益智仁中原兒茶酸對PC12細胞保護作用研究.pdf

1、本研究選用與多巴胺能神經(jīng)元有許多相似特征的PC12細胞為實驗對象，以過氧化氫(H2O2)、谷氨酸(Glu)、及1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+)等神經(jīng)毒素分別誘導細胞損傷，從而建立體外多巴胺能細胞的氧化應激模型。結(jié)果表明，以上三種毒素均可對多巴胺能的PC12細胞產(chǎn)生毒性作用，在一定濃度范圍內(nèi)其毒性作用呈劑量和時間依賴關系。在此基礎上，選擇H2O20.4mM(24h)、Glu10mM(48h)、及Mpp+1mM(48h)作為下一步實驗

2、的模型條件。 通過以上建立的損傷模型，對益智仁中的神經(jīng)活性部位進行跟蹤篩選。實驗發(fā)現(xiàn)，益智仁的乙酸乙酯部位具有明顯的抗氧化應激介導的保護作用；對其進一步分離純化，最終得到一個活性單體化合物。采用光譜學技術(紅外、紫外、核磁共振波譜和質(zhì)譜)對得到的單體化合物進行結(jié)構解析，最后鑒定為一種酚類化合——3，4-羥基苯甲酸，即原兒茶酸(Protocatechuicacid，PCA)。PCA從益智仁中分離得到目前尚未見有文獻報道。在0.06

3、～1.2mM的劑量范圍內(nèi)，PCA對細胞具有一定的增殖作用，而且劑量依賴地保護了氧化應激所致的細胞死亡。通過比較在不同損傷模型中的半數(shù)有效劑量(IC50)發(fā)現(xiàn)，PCA對Mpp+介導的細胞損傷具有更加明顯的保護作用，這個結(jié)果提示了PCA在不同毒素中的不同作用機制。 利用H2O2造成PC12細胞的直接氧化應激損傷，探討PCA在神經(jīng)細胞中的抗氧化機制。培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)的測定與MTT的結(jié)果基本一致，PCA劑量依賴地減少了細胞中

4、LDH的漏出；通過細胞核的形態(tài)觀察以及流式細胞儀的分析，PCA可以減少H2O2介導的PC12細胞凋亡性死亡；PCA抗H2O2氧化應激損傷的保護作用與細胞內(nèi)GSH水平的提高及超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)的激活相關，雖然谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性并沒有顯著變化；另外，H2O2和Fe2+可以通過Fenton反應產(chǎn)生羥自由基(·OH)，而PCA同樣顯著減弱了H2O2/Fe2+所致的細胞損傷。這些結(jié)果表明了在受活性

5、氧(ROS)介導的氧化應激損傷時，PCA可以有效的保持PC12細胞內(nèi)的抗氧化防御體系處于正常的水平，從而抑制細胞的功能衰竭而死亡。 利用Mpp+介導的PC12細胞間接氧化應激損傷，探討PCA在神經(jīng)細胞中的抗凋亡機制。LDH分析證明了PCA能夠保護質(zhì)膜的完整性而抑制Mpp+介導的LDH漏出；同樣形態(tài)觀察及流式細胞儀的分析，證實PCA可顯著抑制Mpp+介導的細胞凋亡；而且，實驗還采用AnnexinV-PI雙染的方法分析檢測了細胞凋亡

6、和壞死的比率，PCA能夠劑量依賴地降低凋亡/壞死細胞的比例；PCA抑制Mpp+介導的細胞凋亡可通過阻止膜電位(MMP)的喪失，抑制ROS的產(chǎn)生，減少GSH的耗竭，促進SOD和CAT的激活及拮抗caspase-3的活性和上調(diào)Bcl-2蛋白的表達。這些結(jié)果表明了PCA可能是通過調(diào)節(jié)線粒體的通透性而抑制氧化應激所致的細胞凋亡。 總之，本研究的結(jié)果表明，PCA是益智仁中的主要活性成分之一，有可能在氧化應激介導的神經(jīng)退行性疾病(如PD)的