35﹪氧預(yù)處理對(duì)低氧誘發(fā)PC12細(xì)胞死亡的保護(hù)作用.pdf

1、活性氧包括超氧陰離子(O2-)、過(guò)氧化氫(H2O2)、羥自由基(OH)和其它氧化物，過(guò)去認(rèn)為是有細(xì)胞毒性的，能夠損害脂質(zhì)、蛋白和DNA。除外這些有害作用外，相當(dāng)多的證據(jù)表明許多刺激因素能夠刺激產(chǎn)生小量活性氧，該活性氧可作為對(duì)這些刺激反應(yīng)的第二信使。 以前認(rèn)為缺血預(yù)處理(IPC)能夠保護(hù)組織免受損傷。缺血預(yù)處理已經(jīng)作為生物界的一個(gè)普遍的細(xì)胞保護(hù)機(jī)制?，F(xiàn)在預(yù)處理的概念已經(jīng)擴(kuò)展到非缺血性應(yīng)急反應(yīng)，如活性氧預(yù)處理。 許多刺激可導(dǎo)

2、致活性氧的產(chǎn)生，從而上調(diào)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)的活性。而且，ERK可以通過(guò)激活一系列轉(zhuǎn)錄因子而促進(jìn)B細(xì)胞淋巴瘤白血病2(Bcl-2)基因的表達(dá)。Bcl-2蛋白家族在調(diào)節(jié)程序性死亡過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。 本文旨在研究35％氧氣預(yù)處理3小時(shí)是否能夠保護(hù)1％氧氣誘導(dǎo)的PC12毒性，35％氧氣預(yù)處理誘導(dǎo)的細(xì)胞保護(hù)作用是否和活性氧產(chǎn)生，細(xì)胞外信號(hào)激酶途徑及Bcl-2過(guò)表達(dá)有關(guān)。 方法： PC12細(xì)胞培養(yǎng)液為DMEM

3、液。PC12細(xì)胞先用35％O2預(yù)處理180min，然后恢復(fù)12小時(shí)，最后1％O2低氧暴露72小時(shí)。在35％O2預(yù)處理前培養(yǎng)液換為無(wú)血清培養(yǎng)液。相應(yīng)藥物加入時(shí)間為35％O2預(yù)處理前60min。細(xì)胞活力用MTT法測(cè)定。細(xì)胞內(nèi)ROS檢測(cè)采用對(duì)過(guò)氧化物敏感的熒光探針DCFH-DA和HEt。PC12細(xì)胞用脂質(zhì)體2000和SiRNA按說(shuō)明書操作轉(zhuǎn)染。ERKmRNA分析采用RT-PCR法。ERK、Bcl-2表達(dá)采用Western Blot。

4、結(jié)果： 1.35％O2預(yù)處理對(duì)低氧誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的影響1％氧氣能導(dǎo)致相當(dāng)數(shù)量的PC12死亡。但該細(xì)胞毒性作用能被35％O2預(yù)處理3小時(shí)恢復(fù)12小時(shí)逆轉(zhuǎn)(P<0.01)，而隨后的0、24小時(shí)恢復(fù)無(wú)此作用。 2.ROS產(chǎn)生PC12在35％O2和pyrogallol組相比21％O2組能夠產(chǎn)生更多O2.-，而tempol組產(chǎn)生的O2.-明顯少于35％O2組。35％O2預(yù)處理產(chǎn)生的H2O2相比21％O2預(yù)處理組無(wú)明顯增多。細(xì)胞

5、活力在pyrogallol和35％O2組明顯增強(qiáng)，而在tempol組明顯減弱。 3.ERK表達(dá)35％O2預(yù)處理可以明顯增強(qiáng)細(xì)胞活力和磷酸化的ERK1/2表達(dá)，這些效應(yīng)可被ERK信號(hào)通路阻止劑PD98059而非PKA/PKC和PI3k/Akt通路阻止劑H7和wortmannin明顯減弱。 35％O2誘導(dǎo)的磷酸化ERK1/2的過(guò)表達(dá)可被4-羥-tempol明顯減弱。用21％O2和20μMpyrogallol預(yù)處理同樣能夠誘導(dǎo)

6、磷酸化ERK1/2的大量表達(dá)。而35％O2和過(guò)氧化氫酶預(yù)處理組和35％O2預(yù)處理組，以及21％O2和30μM H2O2預(yù)處理組和21％O2預(yù)處理組磷酸化的ERK1/2表達(dá)無(wú)明顯區(qū)別。 4.ERK SiRNA誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞效應(yīng)RT-PCR顯示RNA干擾后ERKmRNA表達(dá)明顯減少。Western blot分析顯示SP組相比NP組總的和磷酸化的ERK1/2蛋白表達(dá)量明顯受到抑制。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染SiRNA的PC12細(xì)胞相比正常細(xì)胞活

7、力明顯減弱。 5.Bcl-2表達(dá)Bcl-2蛋白和磷酸化的ERK蛋白在35％O2預(yù)處理組相比其它組表達(dá)明顯增加，而在PD組和SiRNA組相比35％O2預(yù)處理組和21％O2預(yù)處理組表達(dá)明顯下降。 結(jié)論： 1.35％O2預(yù)處理3小時(shí)恢復(fù)12小時(shí)能夠保護(hù)低氧誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞毒性。 2.35％O2預(yù)處理的PC12能夠產(chǎn)生O2-，而O2-在抵抗低氧誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞毒力方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。 3.35％O2預(yù)處