吡硫翁銅抗腫瘤作用及其對(duì)硼替佐米的聯(lián)合增敏效應(yīng).pdf

1、背景：
　　蛋白質(zhì)是參與生命活動(dòng)的重要物質(zhì)，維持蛋白質(zhì)合成與降解的動(dòng)態(tài)平衡是一切生命保持正常生理功能的必要條件。細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的降解有兩條途徑，即溶酶體途徑和泛素-蛋白酶體途徑。其中泛素-蛋白酶體途徑（ubiquitin-proteasome pathway,UPP)是真核細(xì)胞、古細(xì)菌和其他一些細(xì)菌胞內(nèi)降解蛋白質(zhì)的通路之一。在真核細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞漿中，80％以上的蛋白質(zhì)，包括調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞程序性死亡以及感染等重要信號(hào)途徑的調(diào)節(jié)

2、蛋白均受此途徑的降解調(diào)控。蛋白酶體的主要功能是蛋白質(zhì)水解作用降解不需要的和損傷的蛋白質(zhì)，其生化本質(zhì)就是通過水解蛋白質(zhì)的肽鍵，把大分子的蛋白質(zhì)水解為短肽片段，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、DNA復(fù)制和修復(fù)、轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)控制等。該通路的功能改變會(huì)引起蛋白質(zhì)降解的異常，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞功能的異常。人體的許多疾病如腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等的發(fā)生與UPP功能異常密切相關(guān)，因此UPP已經(jīng)成為多種疾病治療的新靶標(biāo)。研究和開發(fā)干擾該途徑的藥物,為多種疾病的治

3、療提供了新的治療策略。
　　目前抗腫瘤的主要策略包括烷化劑、抗代謝物和細(xì)胞毒藥物，以及與有絲分裂、拓?fù)洚悩?gòu)酶和酪氨酸激酶相關(guān)的抑制劑。金屬配合物在藥物設(shè)計(jì)和腫瘤治療中展現(xiàn)了獨(dú)特的性質(zhì)，順鉑及其類似物作為睪丸癌和卵巢癌最有效的化療藥物應(yīng)用于臨床一線。但是其存在的毒性也促使新的高效低毒的藥物的開發(fā)。Q.Ping Dou等人報(bào)道銅的配合物具有抑制細(xì)胞26S蛋白酶體的功能，為蛋白酶體抑制劑的開發(fā)開辟了新途徑。
　　研究目的：

4、　　本研究前期實(shí)驗(yàn)表明吡硫翁銅（Copper Pyrithione,CuPT）對(duì)細(xì)胞上26S蛋白酶體有明顯的活性，對(duì)純化的20S蛋白酶體則沒有抑制效應(yīng)，提示CuPT可能作用于19S進(jìn)而影響26S蛋白酶體活性的。進(jìn)一步的研究表明CuPT對(duì)19S RP去泛素化酶USP14、Uch-L5和Rpn11(POH1)具有抑制效應(yīng)。因此如果將去泛素化酶CuPT和20S蛋白酶體抑制劑硼替佐米(Bortezomib,Velcade)聯(lián)合應(yīng)用將對(duì)腫瘤細(xì)胞的

5、泛素-蛋白酶體通路起到雙重抑制的效應(yīng)，從發(fā)揮更好的抗腫瘤效應(yīng)。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1、細(xì)胞活力測(cè)定：采用MTS法檢測(cè)去泛素化酶抑制劑CuPT聯(lián)合20S蛋白酶體抑制劑萬(wàn)珂（Velcade,Vel）對(duì)腫瘤細(xì)胞活力的影響。
　　2、細(xì)胞死亡檢測(cè)：采用AnnexinV-FITC/PI雙染熒光顯微鏡觀察并拍照記錄CuPT聯(lián)合Velcade（Vel）對(duì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化；同時(shí)用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞死亡情況。
　　3、裸鼠載體實(shí)

6、驗(yàn)：NCI-H929接種裸鼠兩側(cè)腋下，CuPT2.5mg.kg-1腹腔注射觀察并記錄給藥組和對(duì)照組裸鼠體重和腫瘤體積的變化，并在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候取材。
　　4、特定蛋白檢測(cè)：采用 Western bolt檢測(cè)CuPT聯(lián)合 Velcade對(duì)蛋白酶體系統(tǒng)內(nèi)源性泛素化蛋白（Ub-proteins,Ub-pros.），泛素-蛋白酶體通路底物蛋白c-Jun、IκBα，細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白p27、Bax、pro-Caspase3、pro-Caspase

7、8、pro-Caspase9及PARP的影響。
　　結(jié)果：
　　（一）CuPT與Velcade聯(lián)合對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性、蛋白酶體泛素化底物及細(xì)胞死亡相關(guān)蛋白的變化
　　1.CuPT與Velcade聯(lián)合對(duì)人骨髓瘤細(xì)胞 U266和人骨髓瘤NCI-H929的增值抑制效應(yīng)
　　1.1細(xì)胞活力變化不同濃度的CuPT（12.5nM、25nM、50nM、100nM、200nM和400nM）與不同濃度的 Velcade（10nM、1

8、5nM、20nM、25nM和30nM）聯(lián)合作用于人骨髓瘤細(xì)胞U266和人骨髓瘤細(xì)胞NCI-H929細(xì)胞株24小時(shí)和48小時(shí)后MTS法檢測(cè)細(xì)胞活力明顯下降，作用優(yōu)于CuPT和Velcade的單獨(dú)用藥組，聯(lián)合指數(shù)小于1，表明 CuPT對(duì) Velcade有增敏效應(yīng)，并且這種效應(yīng)存在劑量依賴。
　　1.2細(xì)胞死亡變化不同濃度的CuPT（25nM、50nM和100nM）與20nM的Velcade聯(lián)合作用于人骨髓瘤細(xì)胞NCI-H929細(xì)胞株1

9、8小時(shí)，AnnexinV-FITC/PI雙染熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)CuPT與Velcade聯(lián)合用藥組細(xì)胞死亡明顯多于CuPT單獨(dú)用藥組。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示CuPT單獨(dú)用藥組的細(xì)胞死亡率18小時(shí)分別為4%、4.3%和3.7%；CuPT與 Velcade聯(lián)合用藥組細(xì)胞死亡率18小時(shí)分別為34.5%、32.4%和30.7%。并且CuPT與Velcade聯(lián)合用藥組的細(xì)胞死亡以晚期凋亡和壞死為主。
　?。ǘ┘?xì)胞泛素化底物以及死亡相關(guān)蛋白的變化

10、
　　1.CuPT以及CuPT與Velcade聯(lián)合對(duì)人骨髓瘤細(xì)胞U266細(xì)胞株泛素化底物以及死亡相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)
　　不同濃度的CuPT（50nM、100nM、200nM和400nM）單獨(dú)用藥以及它們與20nM的Velcade聯(lián)合作用于人骨髓瘤細(xì)胞 U26618小時(shí)，Western Blot結(jié)果顯示不同濃度的CuPT單獨(dú)給藥時(shí)泛素化底物增加不明顯，只在400nM是有少許泛素化底物蛋白增加，而聯(lián)合用藥組泛素化底物蛋白明顯優(yōu)于Cu

11、PT單藥組；而且K48-聯(lián)接的多聚泛素化底物要明顯多于K63-聯(lián)接的多聚泛素化底物；同時(shí)CuPT400 nM以及CuPT和Velcade聯(lián)合用藥組均能增加泛素-蛋白酶體通路底物蛋白c-Jun。
　　2.CuPT以及CuPT與Velcade聯(lián)合對(duì)人骨髓瘤細(xì)胞NCI-H929泛素化底物以及死亡相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)
　　不同濃度的CuPT（50nM、100nM和200nM）單獨(dú)用藥以及它們與20nM的Velcade聯(lián)合作用于人骨髓瘤細(xì)胞

12、NCI-H929細(xì)胞株18小時(shí)，Western Blot結(jié)果顯示聯(lián)合用藥組能顯著增加泛素化底物，誘導(dǎo)pro-caspase3/8/9的減少，PARP裂解，轉(zhuǎn)錄因子c-Jun、CDI p27KIP1、促凋亡蛋白Bax增加，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡。
　　3.CuPT以及CuPT與 Velcade聯(lián)合對(duì)人肝癌細(xì)胞 Hep G224小時(shí)泛素化底物以及死亡相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)
　　不同濃度的CuPT（50nM、100nM和200nM）單獨(dú)用藥以及

13、它們與20nM的Velcade聯(lián)合作用于人肝癌細(xì)胞Hep G224小時(shí)，Western Blot結(jié)果顯示Velcade組與聯(lián)合用藥組泛素化底物顯著增加，CDI p27KIP1、促凋亡蛋白Bax增加，PARP裂解。
　?。ㄈ〣SO和NAC對(duì)CuPT引發(fā)的總的泛素化底物以及 K48位聯(lián)接泛素化底物和K63聯(lián)接的泛素化底物的影響
　　不同濃度的CuPT(0.25μM,0.5μM和0.75μM)作用兩小時(shí)后，分別加入100μM的

14、BSO和100μM的NAC。其中BSO可以增強(qiáng)CuPT的效應(yīng)，而NAC則可以逆轉(zhuǎn)CuPT的效應(yīng)。
　?。ㄋ模〤uPT對(duì)BALB/c裸鼠異種移植瘤的影響
　　1.CuPT2.5mg/kg給藥五天，裸鼠體重的變化（圖12.A）腫瘤組織（圖12.B）以及對(duì)照組與用藥組平均瘤重對(duì)比（圖12.C），腫瘤生長(zhǎng)抑制率為71.3%(p=0.001，<0.05)，兩組之間存在顯著性差異。
　　2.CuPT對(duì)裸鼠模型腫瘤組織相關(guān)蛋白的影響

15、：用藥組較對(duì)照組泛素化底物蛋白增加，CDI p27KIP1、促凋亡蛋白Bax、核因子IκBα、泛素-蛋白酶體通路底物蛋白c-Jun增加，PARP裂解。
　　結(jié)論：
　　1．CuPT作為去泛素化酶的抑制劑具有引起內(nèi)源性泛素化底物蛋白積累、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，在與20S蛋白酶體抑制劑Velcade聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，通過抑制泛素-蛋白酶體通路中不同的酶（19S RP去泛素化酶和20SCP水解酶活性）從而顯著增加腫瘤細(xì)胞死亡，增強(qiáng)Velc