動(dòng)態(tài)增強(qiáng)核磁共振顯像監(jiān)測(cè)硼替佐米對(duì)腫瘤微循環(huán)的影響.pdf

1、[研究目的]:新一代多靶向抗腫瘤藥物蛋白酶體抑制劑硼替佐米已被批準(zhǔn)用于多發(fā)性骨髓瘤和蔓狀細(xì)胞淋巴瘤的臨床治療，但其在實(shí)體瘤的應(yīng)用尚處臨床試驗(yàn)階段，明確其抗實(shí)體瘤的關(guān)鍵生物學(xué)機(jī)制、建立早期療效評(píng)價(jià)指標(biāo)、早期篩選對(duì)治療有效的患者是治療成功與否的關(guān)鍵。體外研究發(fā)現(xiàn)硼替佐米對(duì)乏氧狀態(tài)下的腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞均有較強(qiáng)的選擇性細(xì)胞毒性作用;臨床活檢標(biāo)本發(fā)現(xiàn)其顯著抑制細(xì)胞乏氧應(yīng)答，降低細(xì)胞應(yīng)對(duì)乏氧負(fù)荷的能力;血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷可能影響微血管的功能，

2、降低微循環(huán)血流，進(jìn)一步加重腫瘤細(xì)胞的損傷。本研究擬1）在組織學(xué)水平明確治療前腫瘤乏氧微環(huán)境在硼替佐米治療腫瘤中的作用以及硼替佐米對(duì)腫瘤微循環(huán)的影響;2）探討通過(guò)動(dòng)態(tài)增強(qiáng)核磁共振顯像監(jiān)測(cè)硼替佐米對(duì)腫瘤微循環(huán)的影響，進(jìn)而間接反映硼替佐米抗腫瘤生物學(xué)效應(yīng)的可行性。
　　 [研究方法]:應(yīng)用已建立的含雙乏氧應(yīng)答報(bào)告基因-9個(gè)乏氧反應(yīng)元件(hypoxia response element, HRE)驅(qū)動(dòng)的單純皰疹病毒1胸苷激酶(herpe

3、ssimplex virus type1 thymidine kinase，HSV1-TK)和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescence protein，eGFP)融合基因的HT29人結(jié)直腸癌細(xì)胞株(HT29-9HRE-TKeGFP，簡(jiǎn)稱HT29-9HRE)及其移植瘤模型進(jìn)行如下研究。1）體外實(shí)驗(yàn):驗(yàn)證硼替佐米能夠有效抑制HT29-9HRE細(xì)胞的乏氧應(yīng)答。常氧(21％ O2)/乏氧(0.2％O2)條件下培

4、養(yǎng)，同時(shí)給予不同藥物濃度的硼替佐米治療，流式細(xì)胞儀檢測(cè)乏氧應(yīng)答報(bào)告基因eGFP的表達(dá)，液體閃爍儀測(cè)定乏氧應(yīng)答報(bào)告基因TK的功能，蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)乏氧誘導(dǎo)因子-1α亞單位（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)及乏氧應(yīng)答下游產(chǎn)物碳酸酐酶9(carbonic anhydrase9，CA9)的表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定乏氧應(yīng)答下游產(chǎn)物血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth f

5、actor，VEGF)的濃度，每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次。2）體內(nèi)實(shí)驗(yàn):在組織學(xué)水平明確治療前腫瘤乏氧微環(huán)境在硼替佐米抗腫瘤中的作用及其與乏氧應(yīng)答抑制之間的關(guān)系，以及硼替佐米對(duì)腫瘤微循環(huán)的作用。右下肢皮下荷HT29-9HRE移植瘤裸鼠隨機(jī)分為硼替佐米(2mg/kg)治療組或PBS對(duì)照組（8～10只/組）。荷瘤鼠于治療前2小時(shí)、治療后20小時(shí)和治療后24小時(shí)分別被給予外源性乏氧示蹤劑pimonidazole、外源性乏氧示蹤劑EF5、血流示蹤劑H

6、oechst33342，1分鐘后處死。隨后即刻取瘤、包埋、冰凍、固定、常規(guī)/熒光免疫組化染色、顯微鏡檢查，并行以下分析:①評(píng)價(jià)硼替佐米對(duì)HT29-9HRE移植瘤的抗腫瘤療效及其對(duì)腫瘤微循環(huán)的作用——定量分析硼替佐米/PBS治療后24小時(shí)，腫瘤整體、腫瘤細(xì)胞、腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡標(biāo)志物cleaved caspase3(CCP3)陽(yáng)性百分比（即整體凋亡率、腫瘤細(xì)胞凋亡率和腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率）;定性觀察發(fā)生凋亡的腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞所處微血

7、管的組織學(xué)形態(tài)特征及凋亡對(duì)局部微血管功能（即血流灌注）的影響;定量分析硼替佐米治療后腫瘤血流示蹤劑Hoechst33342的陽(yáng)性百分比。②分析硼替佐米的抗腫瘤效應(yīng)與腫瘤局部乏氧微環(huán)境和乏氧應(yīng)答抑制間的關(guān)系——將腫瘤大體組織切片顯微鏡圖像劃分為一系列1×1 mm2的微小區(qū)域，依據(jù)第一個(gè)乏氧示蹤劑pimonidazole在各區(qū)域內(nèi)的分布情況，將腫瘤局部微環(huán)境的初始乏氧程度分為輕(＜10％)、中(＞10％)、重(＞20％)三度。定性、定量分析

8、不同初始乏氧程度腫瘤微環(huán)境內(nèi)，硼替佐米治療組和PBS對(duì)照組的凋亡標(biāo)記物CCP3（抗腫瘤效應(yīng)）、內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CD31（微血管的形態(tài)）、血流示蹤劑Hoechst33342（微循環(huán)功能）、兩個(gè)乏氧示蹤劑pimonidazole和EF5（乏氧的動(dòng)態(tài)變化）、以及乏氧應(yīng)答下游產(chǎn)物CA9（乏氧應(yīng)答情況）空間分布的差異。3）動(dòng)態(tài)增強(qiáng)核磁共振顯像(Dynamic contrast enhanced magneticresonance imaging，D

9、CE MRI):活體監(jiān)測(cè)硼替佐米治療后腫瘤血流的動(dòng)態(tài)變化。右季肋部皮下荷HT29-9HRE移植瘤裸鼠，應(yīng)用自制1H MR螺線圈，行移植瘤局部初始DCE MRI檢查，隨后隨機(jī)分為非治療組、單劑量(2mg/kg)治療組和雙劑量（1.5mg/kg，兩次給藥間隔24小時(shí)）治療組（6～8只/組），并分別于初次給藥后24小時(shí)和48小時(shí)再次行移植瘤局部DCE MRI檢查，分別評(píng)價(jià)硼替佐米連續(xù)治療對(duì)腫瘤微循環(huán)的持續(xù)影響，以及單次治療后腫瘤微循環(huán)的動(dòng)態(tài)變

10、化。定性、定量評(píng)價(jià)指標(biāo):獲取DCE MRI圖像各體素時(shí)間-信號(hào)強(qiáng)度曲線，應(yīng)用Hoffman模型擬合計(jì)算其幅度A與交換率kep的乘積（簡(jiǎn)稱Akep），間接定量腫瘤組織各體素的血流/灌注量，并生成相應(yīng)腫瘤層面MR圖像的Akep偽彩圖，反映腫瘤的血流分布;根據(jù)腫瘤全部體素的Akep分布直方圖，獲取其中位數(shù)值(median Akep)代表腫瘤的平均血流量。4）結(jié)合離體實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證DCE MRI顯像結(jié)果與硼替佐米抗腫瘤生物學(xué)效應(yīng)間的關(guān)系。末次DCE

11、 MRI結(jié)束2小時(shí)后尾靜脈注射血流示蹤劑Hoechst33342，1分鐘后處死，隨后重復(fù)前述組織學(xué)實(shí)驗(yàn)步驟。定性比較血流示蹤劑Hoechst33342顯微鏡圖像與DCE MRI的Akep偽彩圖對(duì)腫瘤微循環(huán)的顯示;定性分析硼替佐米治療后腫瘤微循環(huán)和乏氧應(yīng)答的動(dòng)態(tài)變化;探討應(yīng)用DCE MRI顯像評(píng)價(jià)硼替佐米抗腫瘤生物學(xué)效應(yīng)的可行性。
　　 [結(jié)果]:1）體外實(shí)驗(yàn):證實(shí)硼替佐米阻斷HIF-1α在HT29-9HRE細(xì)胞內(nèi)的降解，并抑制H

12、IF乏氧應(yīng)答。經(jīng)硼替佐米治療后，有氧和乏氧培養(yǎng)條件下，細(xì)胞內(nèi)的HIF-1α均明顯堆積，乏氧狀態(tài)下更為顯著。HIF-1α的堆積卻不能啟動(dòng)有效的乏氧應(yīng)答:乏氧培養(yǎng)的HT29-9HRE細(xì)胞乏氧應(yīng)答報(bào)告基因產(chǎn)物eGFP的表達(dá)和TK的功能均降至常氧培養(yǎng)水平;乏氧應(yīng)答下游產(chǎn)物CA9和VEGF的產(chǎn)量也降低至常氧水平。2）體內(nèi)實(shí)驗(yàn):①硼替佐米治療后，HT29-9HRE移植瘤的凋亡率顯著升高，其中血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡導(dǎo)致血流灌注量顯著降低。治療組和非治療組

13、凋亡標(biāo)記物CCP3陽(yáng)性百分比分別為5.26％±0.98％和0.58％±0.13％(P＜0.001);其中非治療組CCP3僅分布在腫瘤細(xì)胞內(nèi);治療組3.28％±0.63％的CCP3位于腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞，1.98％±0.41％(P＜0.05)位于腫瘤細(xì)胞。凋亡的內(nèi)皮細(xì)胞所處微血管的形態(tài)多無(wú)明顯管腔形成，呈點(diǎn)、條狀，幾乎無(wú)血流灌注;腫瘤的整體血流灌注量也明顯降低（對(duì)照組和治療組Hoechst33342的陽(yáng)性百分比分別為18.72％±2.59％

14、和3.57％±0.83％，P＜0.001）。②硼替佐米誘導(dǎo)的凋亡與腫瘤微環(huán)境的初始乏氧程度、以及乏氧應(yīng)答的抑制密切相關(guān)。對(duì)照組移植瘤內(nèi)幾乎無(wú)明顯凋亡;新生乏氧細(xì)胞群體(EF5“+”)的比例與初始乏氧細(xì)胞群體(Pimo“+”)的比例相似;EF5陽(yáng)性細(xì)胞均有相應(yīng)的乏氧應(yīng)答下游產(chǎn)物CA9表達(dá);但CA9的表達(dá)能力隨初始乏氧程度的加重而逐漸降低;微循環(huán)的血流也逐級(jí)下降。經(jīng)硼替佐米治療后，凋亡主要分布在中重度乏氧區(qū)域，cleaved caspase

15、3陽(yáng)性百分比分別為7.54％±1.31％和7.92％±1.12％，腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞均可見(jiàn)明顯的凋亡信號(hào)，且該區(qū)域的乏氧程度明顯增加，新舊乏氧腫瘤細(xì)胞的保護(hù)性乏氧應(yīng)答產(chǎn)物CA9表達(dá)均明顯受抑;而在輕度乏氧區(qū)域，cleaved caspase3陽(yáng)性百分比僅為1.08％±0.32％(P＜0.001)，僅點(diǎn)、條狀分布的細(xì)小血管見(jiàn)凋亡信號(hào)，中間大部分腫瘤細(xì)胞均無(wú)凋亡啟動(dòng)，腫瘤的乏氧程度無(wú)明顯增加（無(wú)明顯的EF5染色），而CA9的表達(dá)亦無(wú)明顯

16、的受損。3) DCE MRI顯像能夠有效監(jiān)測(cè)硼替佐米治療后移植瘤微循環(huán)的動(dòng)態(tài)變化。硼替佐米單劑量治療組，腫瘤平均血流量給藥后24小時(shí)顯著降低（以中央部為著），48小時(shí)恢復(fù)至治療前水平;腫瘤平均血流(Akep中位值)治療前、治療后24小時(shí)和48小時(shí)分別為0.072±0.017、0.018±0.010(P＜0.05)和0.068±0.018/min;雙劑量治療組，腫瘤平均血流量進(jìn)行性下降，24小時(shí)以中央部血流降低為主，48小時(shí)中央部和周邊部

17、血流均顯著降低。腫瘤平均血流(Akep中位值)治療前、治療后24小時(shí)和48小時(shí)分別為0.072±0.017、0.037±0.013和0.022±0.010/min（P＜0.05）。4）離體實(shí)驗(yàn)證實(shí)DCE MRI顯像能夠間接反映硼替佐米的抗腫瘤生物學(xué)效應(yīng)。血流示蹤劑Hoechst33342的分布與末次DCE MRI顯像的Akep偽彩圖對(duì)微循環(huán)血流的顯示相似:對(duì)照組Akep偽彩圖和Hoechst33342顯微鏡圖像均顯示腫瘤的周邊和中央均有

18、一定的微循環(huán)血流分布;單次給藥后48小時(shí)，Akep偽彩圖和Hoechst33342顯微鏡圖像均顯示腫瘤內(nèi)的血流分布與對(duì)照組相似，腫瘤的周邊和中央均見(jiàn)微循環(huán)血流灌注，說(shuō)明此時(shí)硼替佐米對(duì)腫瘤血流的影響已降低/消失;連續(xù)給藥后，兩種影像均顯示僅腫瘤的周邊區(qū)域有少量微循環(huán)血流，中央部幾乎無(wú)血流灌注，說(shuō)明隨著硼替佐米的連續(xù)治療，腫瘤血流持續(xù)降低。硼替佐米治療后腫瘤微循環(huán)的動(dòng)態(tài)變化與其對(duì)乏氧應(yīng)答抑制的動(dòng)態(tài)變化方向一致:單次給藥后48小時(shí)，隨著腫瘤微

19、循環(huán)的改善，CA9的表達(dá)亦恢復(fù)，接近對(duì)照組水平;連續(xù)給藥后腫瘤內(nèi)的血流灌注進(jìn)行性降低，CA9的表達(dá)亦持續(xù)受抑。
　　 [結(jié)論]:腫瘤微環(huán)境的初始乏氧程度在硼替佐米抗腫瘤中起決定性作用。乏氧的血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞是硼替佐米誘導(dǎo)凋亡的主要群體，并與硼替佐米阻斷乏氧應(yīng)答密切相關(guān)。血管結(jié)構(gòu)不良、處于中重度乏氧狀態(tài)的腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)硼替佐米更為敏感，易于凋亡，并導(dǎo)致局部微血管關(guān)閉、血流降低、進(jìn)一步加重腫瘤乏氧。DCE MRI能夠有效監(jiān)