硼替佐米干預(yù)對Allo-HSCT后aGVHD進程的影響及機制研究.pdf

1、一、兩種不同預(yù)處理方式建立小鼠異基因造血干細胞移植急性移植物抗宿主病(aGVHD)模型
　　 目的：利用兩種不同的預(yù)處理方式建立小鼠異基因造血細胞移植aGVHD模型。
　　 方法：25只SPF級BALB/c小鼠分為5組，分別接受7、7．5、8、8．5、9Gy60Coγ射線全身照射。C57BL/6(H—2b，♂)小鼠為供鼠，BALB/c小鼠(H—2d，♀)為受鼠。20只BALB/c小鼠經(jīng)預(yù)處理后隨機分為4組，分別尾靜脈輸注

2、1×106、2．5×106、5×106、10×106個骨髓細胞重建造血。在能重建造血的基礎(chǔ)上建立aGVHD模型，輸注10×106個骨髓細胞基礎(chǔ)上再輸注1×106、2．5×106、5×106或10×106個脾細胞。減弱強度的預(yù)處理方式用藥物加小劑量的輻照方式，于移植前第8天開始腹腔注射氟達拉濱(fludarabine；200mg/kg)至第4天，接著腹腔注射環(huán)磷酰胺(cyclophoshpamide；60mg/kg)至移植前1天，最后在移

3、植前60Coγ射線全身照射(4Gy)，建立aGVHD模型，觀察小鼠生存狀態(tài)及生存率。HE染色檢測靶器官病理組織切片，流式細胞術(shù)檢測小鼠嵌合度。
　　 結(jié)果：接受TBI7，7．5，8，8．5和9Gy預(yù)處理的小鼠中，照射7Gy小鼠全部存活，照射7．SGy小鼠中位生存期為31天，40天60％死亡。照射8Gy小鼠中位生存期為21天，40天內(nèi)80％死亡。照射8．5Gy小鼠中位生存期為14天，40天內(nèi)100％死亡。照射9Gy小鼠中位生存期為

4、8天，40天內(nèi)100％死亡。采用Log—rank檢驗分析生存時間，x2=24．72，P<0．0001。輸注5×106骨髓細胞可全部重建造血，100天生存率為100％。單純輸注骨髓細胞不會誘發(fā)aGVHD。低劑量脾細胞輸注小鼠aGVHD程度輕，40％出現(xiàn)aGVHD性相關(guān)死亡；5×106劑量脾細胞輸注小鼠100％出現(xiàn)aGVHD相關(guān)死亡，疾病嚴重程度屬于中等，中位生存期為19天。10×106劑量脾細胞輸注小鼠100％出現(xiàn)aGVHD相關(guān)死亡，疾病

5、嚴重程度屬于重度。5×106劑量脾細胞組出現(xiàn)典型的aGVHD病理表現(xiàn)，21天后為完全供體嵌合狀態(tài)。
　　 減弱強度的預(yù)處理方式建立的模型，選用中等強度的脾細胞(5×106)，骨髓細胞為(1×107)；其中位生存期為18天，21天后為供受體混合嵌合狀態(tài)。
　　 結(jié)論：8．5Gy TBI對于BALB/c小鼠是清髓性照射劑量。預(yù)處理后輸注5×106個骨髓細胞可全部重建造血。輸注5×106個脾細胞可誘發(fā)中度程度aGVHD；而輸注

6、10×106個脾細胞可誘發(fā)嚴重程度aGVHD。
　　 二、硼替佐米對宿主DC的調(diào)節(jié)作用及其對aGVHD的影響
　　 目的：蛋白酶體抑制劑硼替佐米移植后早期注射(移植后0—2天)可以預(yù)防aGVHD的發(fā)生。本研究旨在探討硼替佐米對宿主DC的調(diào)節(jié)作用及其對aGVHD的影響。揭示硼替佐米在移植后早期注射延緩aGVHD是通過其對DC成熟與功能的抑制作用實現(xiàn)的。
　　 方法：體外在GM—CSF和IL—4條件下利用骨髓來源培養(yǎng)

7、的DC，經(jīng)過不同濃度硼替佐米處理后，流式細胞術(shù)檢測協(xié)同共刺激分子CD40、CD80、CD86及MHC—Ⅱ類抗原表達。用經(jīng)過不同濃度硼替佐米處理后的DC加入OVA肽段，與OT—Ⅰ小鼠磁珠分離CD8+T細胞共育。胞內(nèi)染色觀察CD8+T細胞IL—2、IFN—γ和TFNF—α表達情況，同時檢測上清中上述三種細胞因子的分泌量。EMSA檢測經(jīng)過不同濃度硼替佐米預(yù)處理的DC的NF—κB的入核活性。利用骨髓來源的培養(yǎng)DC經(jīng)過不同濃度硼替佐米預(yù)處理后的D

8、C與異基因小鼠脾細胞共育，[3H]—TdR摻入法檢測硼替佐米處理后DC對異基因淋巴細胞增殖的影響。體內(nèi)利用硼替佐米預(yù)處理的宿主DC輸入到aGVHD小鼠體內(nèi)，觀察小鼠生存狀態(tài)及生存率。
　　 結(jié)果：小鼠骨髓來源的細胞在GM—CSF(10ng/mL)和IL—4(1 ng/mL)培養(yǎng)7天后CD11c陽性率為85％以上。經(jīng)過不同濃度硼替佐米處理的DC在LPS刺激后，CD40、CD80、CD86及MHC—Ⅱ類抗原表達下調(diào)，呈現(xiàn)出明顯的劑量

9、依賴性。經(jīng)過硼替佐米處理的DC與OT—Ⅰ CD8+T細胞共育后檢測胞內(nèi)細胞因子流式圖顯示：CD8+TNF—α+T和CD8+INF—γ+T細胞數(shù)目逐漸減少，呈現(xiàn)出劑量依賴性。細胞上清細胞因子檢測顯示：CD8+T分泌TNF—α和INF—γ量逐漸減少，而IL—2的水平并無明顯變化。EMSA結(jié)果顯示，經(jīng)過硼替佐米預(yù)處理的imDC在LPS刺激條件下NF—κB入核量減少，并且呈現(xiàn)出濃度依賴性。經(jīng)過不同濃度硼替佐米處理的DC與異基因脾細胞進行MLR實

10、驗結(jié)果顯示：DC在經(jīng)硼替佐米(2nM、10nM和50nM)處理后，其激活異基因T細胞增殖的能力隨著硼替佐米濃度的增高而逐漸減弱。經(jīng)過50nM硼替佐米處理后的1×106宿主DC輸入aGVHD模型小鼠后，其生存率要明顯高于未用硼替佐米處理而過繼輸入DC的aGVHD小鼠模型。
　　 結(jié)論：經(jīng)過硼替佐米處理的DC其成熟受到抑制，繼而其抗原遞呈能力下調(diào)，導(dǎo)致激活同種異基因淋巴細胞的增殖能力減弱。主要機制是抑制了NF—κB的入核活性。移植后

11、早期注射硼替佐米可能使宿主DC功能下調(diào)，降低了異基因抗原的遞呈，從而預(yù)防了aGVHD的發(fā)生。
　　 三、TLR4通路與IL—1β在硼替佐米延遲注射促進aGVHD過程中的作用
　　 目的：蛋白酶體抑制劑硼替佐米移植后延遲注射(移植后3天以后)可以促進aGVHD的發(fā)生。本研究旨在探討TLR4通路與IL—1β在延遲注射硼替佐米促進GVHD中的作用。
　　 方法：體外系統(tǒng)模擬延遲注射與即時注射硼替佐米對DC和巨噬細胞細胞

12、因子分泌的影響。培養(yǎng)骨髓來源的C57BL/6背景DC，于培養(yǎng)第7天LPS刺激，在LPS刺激前或刺激后加入硼替佐米。實驗分四組：①延遲硼替佐米組：LPS(100ng/mL)刺激6 h后，加入不同濃度硼替佐米共育，24 h后檢測細胞因子濃度。②即時硼替佐米組：先加入不同濃度硼替佐米，6 h后再加入LPS(100ng/mL)刺激。③LPS對照組：直接加LPS刺激。④硼替佐米對照組：直接加不同濃度硼替佐米共育。利用上述方法處理的DC與異基因淋巴

13、細胞進行MLR反應(yīng)，[3H]—TdR摻入法檢測硼替佐米處理后DC對T淋巴細胞增殖影響；ELISA法同時檢測上清中細胞因子TNF—α和IL—1β水平。
　　 體內(nèi)采取三種不同的方式對aGVHD動物模型進行干預(yù)，研究TLR4通路與硼替佐米延遲干預(yù)互作對aGVHD進程的影響。
　　 (1)阻斷TLR4通路對硼替佐米延遲注射促進aGVHD的影響。用TLR4 KO小鼠做為受體，BALB/c為供體，單純輻照法(9．0Gy)建立小鼠G

14、VHD模型，實驗分即時注射硼替佐米組、延遲注射硼替佐米TLR4 KO組、延遲注射硼替佐米C57BL/6組、aGVHD C57BL/6模型對照組和aGVHD TLR4 KO模型對照組，觀察各組小鼠注射硼替佐米后的生存狀態(tài)及生存率。
　　 (2)移植前預(yù)處理產(chǎn)生的不同LPS水平對硼替佐米延遲注射促進aGVHD的影響。運用氟達拉濱加小劑量照射(4Gy)預(yù)處理方式建立小鼠aGVHD模型，檢測不同時間小鼠體內(nèi)的LPS水平；觀察小鼠延遲注射

15、硼替佐米生存率；同時根據(jù)體外模擬實驗結(jié)果設(shè)上調(diào)體內(nèi)LPS濃度實驗，分GVHD模型對照組，延遲注射硼替佐米組，LPS+延遲注射硼替佐米組(建模第3天給GVHD模型鼠先腹腔注射LPS(5 mg/kg)，6 h后注射硼替佐米1次)和LPS對照組(實驗第3天給GVHD模型鼠注射LPS(5 mg/kg)1次)。觀察小鼠生存狀態(tài)及生存率。
　　 (3)阻斷炎性因子IL—1β對硼替佐米延遲注射促進aGVHD的影響。大劑量輻照法建立小鼠aGVH

16、D模型：選用SPF級接受8．5Gy致死劑量60Co輻照的BALB/c小鼠作為受鼠，尾靜脈移植入C57BL/6小鼠1．0×107骨髓細胞和0．5x107脾細胞，建立小鼠aGVHD模型。骨髓移植后第1，3和5天取血，LAL法檢測小鼠LPS血清水平；同時檢測延遲注射硼替佐米組(骨髓移植后第3天注射，連續(xù)2天)、即時注射硼替佐米組(骨髓移植后連續(xù)注射2天)和GVHD模型組的Th1(IFN—γ)，Th2(IL—4)、TNF—α與IL—1β血清水平

17、。用上述方法建立小鼠aGVHD模型，實驗分即時注射硼替佐米組、延遲注射硼替佐米組、阿那白滯素阻斷IL—1β組(骨髓移植后連續(xù)注射2天阿那白滯素)和阿那白滯素阻斷IL—1β+延遲注射硼替佐米組(骨髓移植后注射阿那白滯素阻滯IL—1β2天，第3天注射硼替佐米)。于延遲注射硼替佐米后小鼠瀕死時免疫組織化學(xué)法檢測各組小腸TNFR的表達；ELISA法檢測血清細胞因子濃度；計算GVHD積分；觀察GVHD各組各個臟器(肝臟、皮膚、肺及小腸)HE染色病

18、理組織切片及生存率。
　　 結(jié)果：原代培養(yǎng)的DC在先LPS刺激6 h后與不同濃度硼替佐米的作用下比單用LPS刺激分泌的IL—1β顯著增高(P<0．01)；而TNF—α則無上述現(xiàn)象。我們用同樣的方法也檢測了巨噬細胞，未發(fā)現(xiàn)差異。經(jīng)延遲和即時處理的DC與同種異基因小鼠的脾細胞共育進行MLR實驗，[3H]—TdR法檢測異結(jié)果顯示：較高濃度硼替佐米(50nM和10nM)延遲處理的DC其激活同種異基因淋巴細胞的能力要比LPS組和即時組都要

19、強(P<0．01)。延遲模擬組IL—4水平有顯著意義上升(P<0．05)。
　　 延遲給藥aGVHD小鼠血清細胞因子濃度結(jié)果顯示：延遲注射硼替佐米aGVHD組與aGVHD模型組或即時注射硼替佐米aGVHD組比，移植后第4天小鼠IL—1β和IFN—γ水平升高。
　　 TLR4敲基因建立的aGVHD模型，在延遲注射硼替佐米后不會立即死亡，且其生存率要顯著高于C57BL/6對照組和TLR4 KO模型對照組；而C57BL/6延遲

20、注射組小鼠會立即死亡。
　　 運用氟達拉濱加小劑量輻照法與大劑量單獨輻照法建立的小鼠aGVHD模型相比，前者早期體內(nèi)LPS升高不明顯。不同預(yù)處理產(chǎn)生的LPS水平不同，在氟達拉濱加小劑量輻照組骨髓移植后，第1，3和5天的LPS水平分別為(0．17±0．02)Eu/mL、(0．21±0．04)Eu/mL和(0．23±0．05)Eu/mL；而大劑量輻照預(yù)處理組則為(0．27±0．02)Eu/mL、(0．47±0．02)Eu/mL和(0

21、．69±0．04)Eu/mL。兩種方式比較
　　 結(jié)果：大劑量輻照組LPS濃度顯著高于氟達拉濱加小劑量輻照組(P<0．01)。氟達拉濱加小劑量輻照組LPS水平相對穩(wěn)定，而大劑量輻照組則呈現(xiàn)出逐漸上升趨勢。運用氟達拉濱與小劑量照射預(yù)處理方式建立的小鼠GVHD模型在延遲注射硼替佐米后生存期明顯比大劑量輻照組延長；在上調(diào)LPS實驗中，LPS+延遲注射硼替佐米組與LPS對照組存在明顯差異，腸道腫脹，炎癥表現(xiàn)。
　　 輻照法建立a

22、GVHD模型后，用阿那白滯素阻斷IL—1β可以明顯延長延遲注射硼替佐米小鼠的生存率。血清中IFN—γ與TNF—α下降，IL—4上升。組織病理變化、體重變化、體內(nèi)炎性因子變化均有差異。
　　 結(jié)論：移植后期預(yù)處理造成腸道損傷，LPS激活TRL4通路，此時注射硼替佐米促進了IL—1β的分泌，放大“炎性風暴”，繼而過度激活宿主DC細胞及供者T細胞而促進GVHD進程。證明了TLR4信號通路激活是引發(fā)硼替佐米延遲注射導(dǎo)致GVHD相關(guān)性死亡