MSCs在受體體內(nèi)的分布及對不相合小鼠allo-HSCT后GVHD及GVT影響的實驗研究.pdf

1、一、研究背景和目的 異基因造血干細胞移植（allo-HSCT）是目前治療各種造血系統(tǒng)及非造血系統(tǒng)腫瘤、再生障礙性貧血、自身免疫性疾病及某些遺傳性疾病的主要和有效手段。allo-HSCT的效果、預后、移植后患者的無病生存率、長期生存率及生活質(zhì)量取決于患者移植后免疫系統(tǒng)的重建情況、移植物抗宿主?。℅VHD）的發(fā)生和程度、移植物抗腫瘤（GVT）效應及繼發(fā)感染等。其中，GVHD發(fā)生情況和患者移植后免疫系統(tǒng)重建情況，包括免疫缺陷的程度、持

2、續(xù)時間及是否發(fā)生繼發(fā)性感染等，是影響allo-HSCT效果及預后的關(guān)鍵。移植后GVHD及免疫重建延遲或GVT效應削弱等導致的感染、腫瘤復發(fā)以及第二腫瘤發(fā)生是allo-HSCT后的主要并發(fā)癥和致死原因，嚴重影響患者移植后長期生存率和生活質(zhì)量。因此，降低移植后GVHD發(fā)生率、減輕GVHD嚴重程度、提高GVT效應、減少免疫缺陷持續(xù)時間、減輕免疫缺陷程度及加速免疫系統(tǒng)重建是提高患者移植后長期生存率和生存質(zhì)量的重要方法和手段。 間充質(zhì)干細

3、胞（MSCs）是一種具有多分化潛能的非造血干細胞，廣泛分布于骨髓、臍血、脂肪等組織中。MSCs表面低表達MHC-Ⅰ，不表達MHC-Ⅱ和共刺激分子CD40、CD40L、B7-1、B7-2，同時能逃避同種異基因T淋巴細胞的識別，提示MSCs具有弱免疫原性，能抑制T、B、NK、DC細胞的功能，通過各種途徑釋放細胞因子或通過細胞間直接或（和）間接作用，誘導免疫耐受。MSCs因具有多器官歸巢、優(yōu)先定位于受損傷靶器官、參與細胞分化及免疫調(diào)節(jié)等特點，

4、已被廣泛應用于allo-HSCT后GVHD的預防與治療、器官移植后排斥反應的預防以及組織工程及各種自身免疫性疾病的治療等方面。照射、化療、免疫抑制劑等因素被認為能夠促進MSCs的歸巢以及向組織特異性細胞的分化，但具體機制尚不清楚。目前有關(guān)受體免疫功能是否影響MSCs在體內(nèi)植入的研究較少。本實驗以同基因小鼠及裸鼠模型為基礎(chǔ)，經(jīng)尾靜脈輸注MSCs，應用實時定量PCR法定期追蹤體內(nèi)Y染色體標記MSCs，分別觀察供體細胞在各受鼠體內(nèi)的分布與定居

5、情況，有助于我們了解MSCs是否在正常與免疫缺陷受體中的分布、定居及遷移方面存在差異，為MSCs移植安全性的評價提供前期實驗的研究基礎(chǔ)。 現(xiàn)時預防及治療GVHD的措施主要是大量應用細胞毒藥物及免疫抑制劑，雖然可有效降低GVHD的發(fā)生，但同時也削弱GVT效應，加重移植后患者的免疫缺陷程度，使移植后感染及腫瘤復發(fā)率明顯提高。如何建立特異性免疫耐受減輕GVHD同時保留GVT效應，是改善allo-HSCT效果亟待解決的問題，也是移植免疫

6、學所面臨的難題。近年來，越來越多的研究表明MSCs在造血支持及免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著重要作用，提示MSCs可能在減輕GVHD反應同時增強GVT效應中扮演重要的角色，是應用前景最為廣闊的種子細胞。本研究另外構(gòu)建小鼠MHC不相合allo-HSCT荷瘤動物模型，將第三方KM小鼠骨髓MSCs經(jīng)體外培養(yǎng)后與近交系C57BL/6小鼠的脾臟及骨髓細胞共移植，探討第三方來源MSCs在促進MHC不相合allo-HSCT后免疫重建、誘導免疫耐受的同時對GVT效

7、應的影響。 二、研究方法 1.構(gòu)建同基因小鼠及裸鼠模型 2.實驗分組：分別于輸注MSCs后24h、72h、1w、2w及1w、2w、4w、6w分批處死雌性BALB/c同基因小鼠及裸鼠（5只/批），并依次留取肺臟、肝臟、脾臟、結(jié)腸、胸腺及骨髓組織。 3.實時定量PCR（SYBR Green法）檢測各組受鼠器官組織SRY基因相對表達水平 4.構(gòu)建小鼠MHC不相合allo-HSCT荷瘤動物模型 5

8、.實驗分組：實驗分7組，分別為低劑量第三方MSCs移植組（A組），中劑量第三方MSCs移植組（B組），高劑量第三方MSCs移植組（C組），高劑量供鼠MSCs移植對照組（D組），單純allo-HSCT組（E組），B16+TBI對照組（F組），B16成瘤對照組（G組）。 6、造血重建標準：外周血白細胞計數(shù)（WBC）>1．0×109/L為造血重建指標，并通過嵌合體檢測證實骨髓植入成功。 7.嵌合體檢測：PCR擴增外周血基因組Y

9、染色體基因 8.aGVHD表現(xiàn)與評分標準：aGVHD判斷通過觀察：體重變化、食欲、精神狀態(tài)，活動能力，皮膚黏膜，腹瀉等情況，并計算平均生存時間；另取瀕死受鼠皮膚、肝臟、小腸等組織進行病理學檢查。 9.流式細胞儀（FACS）檢測外周血T淋巴細胞亞群：于骨髓移植后+7d開始，每周每組取3～4只受鼠行FACS檢測外周血CD3+CD4+、CD3+CD8+及CD4+CD25+比例變化。 10.外周血上清細胞因子lFN-γ、

10、IL-2、IL-4及TGF-β檢測：移植后+14d采用ELISA方法進行檢測。 11.移植動物成瘤情況觀察：腫瘤導致死亡判斷標準：動物死亡時WBC）1．5×109/L，腫瘤明顯增大，甚至破潰壞死，無明顯aGVHD臨床表現(xiàn)。待出現(xiàn)可觸及的腫塊時記為腫瘤出現(xiàn)時間，用游標千分尺測量腫瘤的最長直徑（L）和與其垂直的最大橫徑（W），以后每3d測量1次，直至腫瘤出現(xiàn)破潰或小鼠死亡。 12.統(tǒng)計學分析：實驗數(shù)據(jù)采用SPSS13．0統(tǒng)計

11、軟件包進行處理。結(jié)果用均數(shù)±標準差（x±SD）表示，采用析因方差分析分別對不同時間段的同基因小鼠及裸鼠的肺臟、肝臟、脾臟、結(jié)腸、胸腺、外周血及骨髓等臟器組織的SRY基因表達變化差異進行統(tǒng)計分析，多組間比較采用One-way ANOVA進行統(tǒng)計分析，移植后外周血淋巴細胞亞群變化采用重復測量統(tǒng)計分析，組間比較采用LSD或Dunnett's T3多重比較法。一個因變量與多個自變量間的線性數(shù)量關(guān)系用linear regression進行逐步回歸

12、統(tǒng)計分析。P<0．05為差異有統(tǒng)計學意義。并對小鼠生存時間進行Kaplan-Meier生存模型分析，繪制生存時間曲線。缺失數(shù)據(jù)：預處理后存活時間少于5d視為移植失敗，不作統(tǒng)計。 三、結(jié)論 1.MSCs輸注安全，未發(fā)現(xiàn)有毒副作用。 2.MSCs在正常與免疫缺陷或致死量照射的同種異體中的分布、定居及遷移方面存在差異，其植入細胞量及時間與受體免疫功能密切相關(guān)。 3.第三方或供者來源MSCs均可促進MHC不相合a