清熱解毒法聯(lián)合allo-HSCT治療重型再生障礙性貧血的研究.pdf

1、目的:
　　初步總結(jié)應(yīng)用清熱解毒法聯(lián)合異基因造血干細(xì)胞移植(allo-HSCT)治療重型再生障礙性貧血（SAA）的臨床療效;觀察安腦片聯(lián)合異體骨髓細(xì)胞輸注對SAA大鼠模型的干預(yù)效果，及其對CD90.1+細(xì)胞凋亡率和PML凋亡蛋白表達(dá)的影響，探討安腦片干預(yù)SAA大鼠的分子機(jī)制，為臨床應(yīng)用清熱解毒法聯(lián)合allo-HSCT治療SAA提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.回顧性分析2013年10月至2015年12月廣東省中醫(yī)院血

2、液科應(yīng)用清熱解毒法聯(lián)合異基因造血干細(xì)胞移植治療的8例重型再生障礙性貧血患者臨床資料，觀察移植后患者造血重建、植入情況及移植相關(guān)并發(fā)癥。隨訪時(shí)間截至2015年12月，統(tǒng)計(jì)患者總生存率，評價(jià)臨床療效。
　　2.選用SPF級Wistar雌性大鼠作為受鼠，接受直線加速器全身照射，建立重型再生障礙性貧血大鼠模型;SPF級SD雄性大鼠作為供鼠，用于制備異體骨髓細(xì)胞;照射后4小時(shí)內(nèi)，從Wistar大鼠尾靜脈輸注SD大鼠骨髓細(xì)胞，并于輸注后第1天

3、開始給予安腦片藥液灌胃，用至第30天。
　　3.每日記錄各組大鼠一般情況:包括毛發(fā)、體重、活動(dòng)度、飲食量、飲水量、大小便、出血情況、貧血情況等;實(shí)驗(yàn)第7、14、30天，采用眼眶靜脈取血法留取各組大鼠標(biāo)本約1ml，用于血常規(guī)、網(wǎng)織紅細(xì)胞百分比及絕對值檢驗(yàn);實(shí)驗(yàn)第7天取重再組大鼠雙側(cè)股骨，第31天取安腦組和對照組大鼠雙側(cè)股骨，分別用于骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)及組織病理學(xué)觀察。
　　4.留取各組Wistar大鼠血清標(biāo)本保存?zhèn)溆?免疫磁珠法分

4、離正常SD大鼠骨髓CD90.1+細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)研究靶細(xì)胞，于液體培養(yǎng)體系中擴(kuò)增14天，然后與上述各組Wistar大鼠血清共培養(yǎng)24h后，用AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測各組CD90.1+細(xì)胞凋亡率，用間接免疫熒光標(biāo)記法測定其PML蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.8例重型再生障礙性貧血患者均獲得造血重建，中性粒細(xì)胞植活中位時(shí)間為+13.5天，血小板植活中位時(shí)間為+14天;移植后+30天時(shí)復(fù)查所有患者骨髓提示骨髓增

5、生明顯活躍或活躍，STR-PCR顯示均為完全供者嵌合體，植入率100％;供受體性別不同者經(jīng)性染色體檢查均為100％供者型，移植前供受體血型不合者分別在移植后+37天、+49天、+31天和+60天轉(zhuǎn)變?yōu)楣┱哐汀?br>　　2.4例患者發(fā)生aGVHD，發(fā)生率50％，4例患者發(fā)生cGVHD，發(fā)生率50％;7例患者發(fā)生感染，發(fā)生率87.5％;3例患者出現(xiàn)出血性膀胱炎，發(fā)生率37.5％;所有患者均未發(fā)生肝靜脈閉塞病。截至2015年12月31日，

6、8例移植患者中死亡2例，1例患者放棄治療，5例患者獲得生存，且均達(dá)到基本治愈水平，存活率62.5％，治愈率62.5％。
　　3.各組大鼠生存曲線整體比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X2=65.555，P=0.000);組間比較，安腦組較鹽水組與重再組生存時(shí)間明顯延長，差異顯著（X2=42.805，P=0.000）;安腦組與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X2=3.353，P=0.067)。
　　4.實(shí)驗(yàn)第7天各組大鼠血常規(guī)、網(wǎng)織紅細(xì)胞

7、百分比及絕對值結(jié)果顯示，重再組與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。輸注骨髓組（安腦組和鹽水組）也較對照組低下，差異顯著(P＜0.05)，但與重再組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);第14天時(shí)上述檢測結(jié)果提示:輸注骨髓組（安腦組和鹽水組）較第7天時(shí)有所上升，其中尤以安腦組恢復(fù)更為明顯，與鹽水組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但較對照組仍然低下(P＜0.05);第30天安腦組與對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞

8、0.05）。
　　5.與對照組相比，重再組大鼠骨髓組織明顯脂肪化，增生極度低下，造血細(xì)胞極度減低，非造血細(xì)胞增多，骨髓造血組織支架結(jié)構(gòu)稀疏，網(wǎng)狀纖維和毛細(xì)血管網(wǎng)明顯減少，骨髓間質(zhì)水腫并出血。安腦組大鼠骨髓改變較重再組明顯改善。
　　6.各組之間CD90.1+細(xì)胞凋亡率有顯著差異(P＜0.05);組間兩兩比較提示:對照組均明顯低于重再組和安腦組（P均＜0.05），同時(shí)安腦組也低于重再組（P＜0.05）;加入重再組血清后，CD9

9、0.1+細(xì)胞胞內(nèi)PML蛋白表達(dá)有所增加，而安腦組PML蛋白表達(dá)未見明顯增加。
　　結(jié)論:
　　1.清熱解毒法可能在促進(jìn)重型再障移植患者造血重建及供者細(xì)胞植入方面具有良好的作用，臨床上應(yīng)根據(jù)移植患者所表現(xiàn)的不同中醫(yī)證候進(jìn)行早期干預(yù)，有望改善或減緩移植患者的并發(fā)癥。
　　2.安腦片對全身照射誘導(dǎo)的重再大鼠模型具有良好的保護(hù)作用，能促進(jìn)大鼠骨髓紅系細(xì)胞的增殖、分化及成熟，增強(qiáng)異體骨髓細(xì)胞輸注的治療效果，利于異體骨髓細(xì)胞的植入