中國三黃雞可溶性B淋巴細胞刺激因子的克隆、表達和活性研究.pdf

1、B淋巴細胞刺激因子BAFF(B cell activating factor belonging to the TNF family)，是一種B淋巴細胞的共刺激因子；屬TNF超家族成員。Schneider et al．(2004)成功克隆了雞BAFF基因，國內(nèi)對雞BAFF的研究尚未起步。中國三黃雞是中國常見的地方品種雞，本研究根據(jù)GenBank提供的雞BAFF基因序列(GenBank索取號AF506010)，設(shè)計引物，通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶

2、鏈式反應(yīng)，首次從中國三黃雞脾組織細胞中分別擴增得到864bp的雞B淋巴細胞刺激因子(CycBAFF)基因和459bp的雞可溶性B淋巴細胞刺激因子(CycsBAFF)基因片段，一方面通過大腸桿菌系統(tǒng)表達了CycsBAFF蛋白，并對其進行純化，Western blot，復(fù)性和活性的鑒定；另一方面，利用巴斯德畢赤酵母(pichiapastoris)成功構(gòu)建了重組CycsBAFF真核表達載體，為真核表達實驗奠定了基礎(chǔ)。此外，我們還制備了兔抗Cy

3、csBAFF多克隆抗體，通過間接ELISA方法檢測了其效價，以及Western blot檢測其與抗原的結(jié)合性。 1.CycsBAFF的原核表達和活性研究將CycsBAFF片段克隆入原核表達載體pET-28a，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后高效表達了帶有His<,6>標簽的包涵體形式重組蛋白，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳及免疫轉(zhuǎn)印檢測鑒定。表達產(chǎn)物經(jīng)Ni<'2+>-NTA純化后，經(jīng)透析復(fù)性得到活性目的蛋白，通過單獨刺激以及與PMA共刺

4、激體外培養(yǎng)的雞法氏囊B細胞，經(jīng)MTT法檢測，均有明顯的促法氏囊B細胞存活的效應(yīng)。 2.CycsBAFF真核表達載體的構(gòu)建將擴增得到的CycsBAFF片段與畢赤酵母表達載體進行連接，得到重組載體 pPIC9-CycsBAFF，線性化后轉(zhuǎn)化酵母細胞GSll5。 3.兔抗CycsBAFF多克隆抗體的制備及鑒定通過皮下注射重組CycsBAFF蛋白，制得抗CyesBAFF多克隆抗體，間接ELISA法檢測抗血清效價為20000倍；并