斑馬魚Ror2對匯聚延伸運動調(diào)節(jié)機理的研究.pdf

1、Ror2(The receptor tyrosine kinase-like orphan receptor)是RTKs家族中的一員,為單次跨膜受體,在人類的骨骼發(fā)育和癌癥發(fā)生中發(fā)揮了十分重要的作用。在哺乳動物例如小鼠中,Ror2突變體小鼠呈面部畸形,四肢和尾部短小,呼吸系統(tǒng)功能障礙,最終導(dǎo)致新生小鼠致死。在爪蛙中的研究發(fā)現(xiàn),XRor2及其突變體干擾了原腸期的匯聚延伸運動。因此,Ror2在早期胚胎發(fā)育過程中可能發(fā)揮了重要作用,所以我們利

2、用斑馬魚胚胎體外發(fā)育及早期透明等優(yōu)勢,對Ror2在早期胚胎發(fā)育中的功能進行深入研究。前人研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn),Ror2在小鼠和爪蛙中作為一類非Frizzled受體,能夠與Wnt5a相互作用調(diào)節(jié)CE運動。
　　匯聚延伸(CE)運動是原腸胚期的一種重要的細胞運動形式,在脊椎動物早期胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮了十分重要的作用。值得注意的是,多種遺傳學(xué)證據(jù)強調(diào)了在斑馬魚胚胎原腸胚期調(diào)節(jié)CE運動的重要性。雖然Ror2在小鼠和爪蛙中能夠與Wnt5a相互作用調(diào)

3、節(jié)CE運動,然而斑馬魚中,Wnt5a在原腸胚時期的表達量很低,而且Wnt5a敲降后也沒有引起CE缺陷的表型。然而斑馬魚中Wntll的突變體slb顯示了缺陷的CE運動,之前的研究發(fā)現(xiàn),斑馬魚Wntll能夠與Frizzled-7和Flamingo相互作用調(diào)節(jié)細胞運動,那么斑馬魚中Wntll是否能通過Ror2發(fā)揮功能呢?Hiroki Hikasa等研究表明XRor2與XWntll,Xfz7的共過表達能夠協(xié)同抑制匯聚延伸運動。生化實驗表明,XR

4、or2的胞外結(jié)構(gòu)域CRD能夠與XWntll相結(jié)合,這一研究結(jié)果為我們提供了一些信息,但是并未有研究報道Wntll和Ror2體內(nèi)的相互作用功能。因此,以上的論述使我們提出了一些疑問,在斑馬魚中Ror2是否能夠在CE運動中發(fā)揮功能?Wntll對CE運動的調(diào)節(jié)作用是否是通過Ror2的介導(dǎo)?Ror2與Wntll是否能夠相互結(jié)合?這些問題目前還沒有得到解答。本研究的目的就是對上述疑問依次進行探討。
　　我們首先克隆得到了斑馬魚的Ror2基因

5、,通過序列比對發(fā)現(xiàn)斑馬魚Ror2與人、小鼠和爪蛙的Ror2同源性極高。通過RT-PCR分析顯示,Ror2為母源性基因,且隨后的各胚胎時期均有表達,并且值得一提的是,Ror2在6-9hpf表達量較高,這暗示著Ror2有可能在原腸胚期發(fā)揮作用。Ror2的過表達抑制了胚胎在原腸胚期的匯聚和遷移,導(dǎo)致了嚴重的CE缺陷表型,暗示著Ror2在原腸胚期的CE運動中發(fā)揮了一定的調(diào)節(jié)作用。
　　Ror2和Wntll共過表達能協(xié)同加強CE缺陷表型,并

6、且原位雜交markers(hgg、dlx3b、ntl)檢測也證明了這一結(jié)果,這暗示著斑馬魚Wntll可能通過Ror2調(diào)節(jié)CE運動。Ror2 Mos敲降實驗顯示,在原腸胚期Ror2敲降后并沒有導(dǎo)致CE缺陷,產(chǎn)生這一結(jié)果的原因,我們猜測是由于胚胎中存在Rot2的母源性蛋白,而TBMO并不能將其母源性蛋白封閉住,因此敲降表型不明顯。所以,我們隨后又改用Ror2 dominant negative形式Ror2-TM進行敲降。結(jié)果顯示,dnRor

7、2能夠?qū)е螺^為嚴重的CE缺陷,并且隨后的時期胚胎眼部間距變窄,甚至出現(xiàn)獨眼表型,表型與Wntll/silberblick突變體表型類似,暗示著斑馬魚Wntll可能會通過Ror2調(diào)控CE運動。因此我們同樣將Wntll MO和dnRor2進行低劑量共顯微注射,結(jié)果同樣表明兩者的協(xié)同加成作用,并且進一步暗示了Wntll與Ror2的相互作用。而Wntll mRNA與dnRor2共過表達,顯著削弱了WntllmRNA引起的CE缺陷的表型,這一研究

8、從另一方面暗示了兩者的相互作用性。因此為了直接證明這一假設(shè),我們運用CO-ip實驗進行驗證,結(jié)果也證明了Wntll的確能夠與Ror2相結(jié)合。為了進一步研究Wntll通過Rot2調(diào)控CE運動過程中發(fā)揮重要作用的位點,我們構(gòu)建了Rot2突變體,結(jié)果表明Ror2-Y647和-S863位點均能在此過程中發(fā)揮作用。
　　通過以上研究表明,在斑馬魚中,Wntll能夠與Ror2結(jié)合,從而調(diào)控了原腸胚期的匯聚延伸運動,而且這一調(diào)控作用中Ror2的