實(shí)驗(yàn)用魚遺傳檢測方法的建立——對斑馬魚、劍尾魚遺傳檢測方法的研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)用魚是一類重要的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，其中斑馬魚（Danio rerio）和有“環(huán)境監(jiān)測器”之稱的劍尾魚（Xiphophorus helleri）在生命科學(xué)的諸多領(lǐng)域發(fā)揮著不可或缺的作用。雖然這些實(shí)驗(yàn)用魚的功能學(xué)研究開展較早，但涉及遺傳質(zhì)量控制基礎(chǔ)的遺傳監(jiān)測研究較為少見。建立相應(yīng)的遺傳檢測方法，對其進(jìn)行遺傳質(zhì)量控制，保證實(shí)驗(yàn)用魚質(zhì)量穩(wěn)定、結(jié)果可靠，是亟待解決的問題。
　　本課題應(yīng)用生化標(biāo)記和DNA分子標(biāo)記技術(shù)，通過乙酸纖維素薄膜的同工酶電

2、泳、RAPD隨機(jī)擴(kuò)增、STR擴(kuò)增的方法，嘗試從蛋白水平和核酸水平建立實(shí)驗(yàn)用魚的遺傳檢測方法。以封閉群斑馬魚（AB、LF、本地短尾（short tail，ST）各20尾）和近交系劍尾魚（RR-B、RW-H、BY-F各6尾）為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行研究。同時(shí)以近交系劍尾魚為標(biāo)準(zhǔn)，用6尾非選育劍尾魚進(jìn)行了方法的重復(fù)性驗(yàn)證。
　　經(jīng)過研究，在蛋白水平上，斑馬魚肌肉來源同工酶在6-磷酸葡萄糖脫氫酶（Gpd）、過氧化氫酶（Ce）、蘋果酸脫氫酶（Mod）

3、、葡萄糖磷酸異構(gòu)酶（Gpi）、酯酶（ES）這5個(gè)生化位點(diǎn)在三種群中均表現(xiàn)出多態(tài)性。經(jīng)卡方檢驗(yàn)分析，Gpd、Gpi位點(diǎn)群間差異顯著（P<0.01），Ce、Mod有群間差異（P<0.05）。對近交系劍尾魚進(jìn)行了眼睛、肝臟、肌肉的組織特異性研究，發(fā)現(xiàn)大部分酶在肝臟中活性較強(qiáng)。選用代表組織進(jìn)行分析，同一生化位點(diǎn)在各品系內(nèi)表現(xiàn)較為一致。在Gpi、Gpd位點(diǎn)RR-B系表現(xiàn)出特異性條帶，RW-H系在Ce位點(diǎn)表現(xiàn)出特異性條帶。非選育劍尾魚在Gpi、Gp

4、d、Ce位點(diǎn)表現(xiàn)出多態(tài)性。
　　在DNA水平上，經(jīng)過優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，擴(kuò)增篩選了RAPD引物。在斑馬魚和劍尾魚中，分別得到5條和11條穩(wěn)定性較好的對隨機(jī)引物。圖譜直觀分析，斑馬魚AB群在SJD3的隨機(jī)擴(kuò)增產(chǎn)物主帶集中在700bp～900bp之間，而ST、LF群的擴(kuò)增產(chǎn)物2條主帶均在1000bp以上。劍尾魚RR-B系在P30和S97擴(kuò)增產(chǎn)物中表現(xiàn)出特異條帶。RR-B系 P30擴(kuò)增產(chǎn)物存在約1500bp的特異主帶，在S97的擴(kuò)增產(chǎn)物

5、存在300bp至400bp之間的一條特異主帶，可直接判讀與其他品系的差異。按照Nei's原理與生物多樣性分析方法，利用Popgen32軟件分析得到Shannon's指數(shù)Nei基因多樣性指數(shù)（h）均有AB>LF>ST。兩兩比較分析遺傳距離（D）得出 DST&LF<0.2

6、PD圖譜多態(tài)性明顯，并表現(xiàn)出較好重復(fù)性。
　　其次，在斑馬魚、劍尾魚中分別篩選了24對和26對STR引物，均得到4對穩(wěn)定的STR引物。在斑馬魚中，Z9384、Z10508、Z20046這3對引物在群內(nèi)和群間均表現(xiàn)出多態(tài)性。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，Z20046群間差異顯著（P<0.01），Z9384有群間差異（P<0.05），Z10508擴(kuò)增結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。在劍尾魚中，引物AY204223的擴(kuò)增條帶表現(xiàn)出多態(tài)性，在RR-B與B

7、Y-F系表型一致，且與RW-H表型不同。在該微衛(wèi)星克隆位點(diǎn)，非選育劍尾魚亦表現(xiàn)出多態(tài)性條帶。
　　本研究還對兩種實(shí)驗(yàn)用魚中麗春紅染色一種蛋白標(biāo)記進(jìn)行初步探討。該蛋白在封閉群斑馬魚群間表現(xiàn)無差異，在近交系劍尾魚中，僅RR-B系表現(xiàn)出特異譜帶，非選育劍尾魚表現(xiàn)多態(tài)性譜帶。對該蛋白的從屬定性還有待更深入研究。
　　綜上，建立的生化標(biāo)記具有較好重復(fù)性，操作簡便，結(jié)果易判讀，可作為斑馬魚和劍尾魚的遺傳生化標(biāo)記方法；利用隨機(jī)引物和微衛(wèi)星