利用可示蹤轉(zhuǎn)基因斑馬魚研究原始造血和定向造血的關(guān)系及斑馬魚細(xì)胞移植方法的建立.pdf

1、目的：本課題利用已建立的可示蹤的轉(zhuǎn)基因斑馬魚系 TG（zLmo2:Loxp-DsRed-Loxp-EGFP)和TG(zC-myb:EGFP)，通過實(shí)時(shí)跟蹤觀察，從而動(dòng)態(tài)觀測(cè)原始造血干細(xì)胞和定向造血干細(xì)胞的遷移過程，以期了解斑馬魚原始造血和定向造血的關(guān)系，為進(jìn)一步研究斑馬魚血液系統(tǒng)發(fā)育提供可能的理論依據(jù)。
　　方法：分別收集紅色熒光蛋白（DsRed）標(biāo)記原始造血干細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因系 TG（zLmo2:Loxp-DsRed-Loxp-EG

2、FP)和綠色熒光蛋白（EGFP）標(biāo)記定向造血干細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因斑馬魚系TG(zC-myb:EGFP)自交和側(cè)交的斑馬魚胚胎，于12hpf(hours post-fertilization，hpf)去卵膜，進(jìn)行局部麻醉，利用激光共聚焦顯微鏡對(duì)全胚胎進(jìn)行連續(xù)實(shí)時(shí)的動(dòng)態(tài)掃描,從12hpf開始觀察，直至48hpf,期間每隔兩小時(shí)拍攝一次進(jìn)行追蹤觀察。
　　結(jié)果：（1）紅色熒光蛋白（DsRed）標(biāo)記原始造血干細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因系 TG（zLmo2:L

3、oxp-DsRed-Loxp-EGFP)自交后，觀察胚胎發(fā)現(xiàn)lmo2+的細(xì)胞在14hpf開始表達(dá)紅色熒光，主要表達(dá)的部位是在斑馬魚胚胎的頭部中胚層（anterior paraxial mesoderm,ALM），隨后在中間細(xì)胞群（intermediate cell mass,ICM）表達(dá)；18-22hpf發(fā)現(xiàn)紅色熒光標(biāo)記的lmo2+的細(xì)胞在ICM區(qū)表達(dá)逐漸增強(qiáng)，24hpf達(dá)到高峰,30hpf在尾部造血組織（caudal hematopo

4、ietic tissue，CHT）開始表達(dá)，持續(xù)至48hpf。（2）綠色熒光蛋白（EGFP）標(biāo)記定向造血干細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因斑馬魚系TG(zC-myb:EGFP)自交后，觀察綠色熒光標(biāo)記的c-myb+的細(xì)胞,24hpf開始表達(dá)，最初表達(dá)的部位是PBI（posterior bloodisland，PBI）區(qū)，隨后在28hpf表達(dá)逐漸增強(qiáng)，并沿著AGM區(qū)向原腎導(dǎo)管遷移，28hpf在PBI區(qū)和AGM區(qū)的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，持續(xù)到36hpf；此外發(fā)現(xiàn)在28

5、hpf斑馬魚的頭部和胸腺有少量c-myb+細(xì)胞的存在;32-36hpf PBI區(qū)、AGM區(qū)和頭部的c-myb+細(xì)胞逐漸增多；42-48hpf在斑馬魚頭部 c-myb+細(xì)胞逐漸減少（3） TG(zLmo2:Loxp-DsRed-Loxp-EGFP：TG(zC-myb:EGFP)側(cè)交的斑馬魚胚胎，觀察發(fā)現(xiàn)受精后24小時(shí)可以看到PBI區(qū)有少量的又紅又綠的lmo2+和c-myb+的雙陽性細(xì)胞和紅色的lmo2+的細(xì)胞；26hpf PBI區(qū)lmo2

6、+和c-myb+雙陽性細(xì)胞逐漸增多，28hpf lmo2+和c-myb+雙陽性細(xì)胞在PBI區(qū)逐漸增多并向主動(dòng)脈-性腺-中腎（aorta-gonad-mesonephros，AGM）遷移，30-38hpf lmo2+和c-myb+雙陽性細(xì)胞在尾部 PBI區(qū)逐漸增多達(dá)到高峰，其中在此過程中 lmo2+和c-myb+的雙陽性細(xì)胞一部分沿著原腎導(dǎo)管遷移至原腎，另一部分沿著尾靜脈（caudal vein，CV）向尾部造血組織（CHT）遷移。提示定

7、向造血干細(xì)胞的一部分可能由PBI區(qū)原始造血干細(xì)胞分化而來。此外追蹤觀察的過程中發(fā)現(xiàn)在原腎導(dǎo)管處有 c-myb+的細(xì)胞,這群細(xì)胞與lmo2+和c-myb+雙陽性細(xì)胞一起沿著原腎導(dǎo)管向原腎遷移，提示可能一部分定向造血干細(xì)胞來源于內(nèi)皮祖細(xì)胞。此外在側(cè)交后的胚胎中追蹤觀察到，在斑馬魚頭部的延髓部位有少量lmo2+和c-myb+雙陽性的細(xì)胞存在，隨后逐漸增多，持續(xù)到34hpf，提示斑馬魚頭部的延髓可能是定向造血早期一個(gè)新的造血位點(diǎn)。
　　結(jié)