Cdh5在hoxb4轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)胚胎期造血發(fā)育中的表達(dá)及對(duì)造血發(fā)育影響的研究.pdf

1、目的:同源盒基因hoxb4在促進(jìn)造血發(fā)育方面有重要作用,本課題組前期對(duì)hoxb4調(diào)控造血發(fā)育的機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn),hoxb4過(guò)表達(dá)的造血組織rap1的表達(dá)是上調(diào)的,已有的研究顯示在血管的發(fā)育中rap1可調(diào)控cdh5的表達(dá),這些研究提示cdh5可能是hoxb4的下游靶基因,共同參與了造血發(fā)育的調(diào)控。本研究欲探討在hoxb4過(guò)表達(dá)時(shí)cdh5對(duì)造血發(fā)育的作用,以揭示cdh5參與hoxb4調(diào)控造血發(fā)育的機(jī)制。
　　方法:分別收集實(shí)驗(yàn)組(Tgz

2、Lmo2:LDL-Hoxb4-egfp×TgzLmo2:Cre)和對(duì)照組(TgzLmo2:LDL-egfp×TgzLmo2:Cre)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)24hpf、30hpf的胚胎,將其制備為單細(xì)胞懸液,用流式細(xì)胞儀分選表達(dá)綠色熒光蛋白標(biāo)記的成血成血管共同前體細(xì)胞;提取各組標(biāo)本總RNA,并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測(cè)各標(biāo)本中cdh5基因的mRNA表達(dá)量并比較分析其差異。構(gòu)建帶egfp報(bào)告基因的cdh5全長(zhǎng)表達(dá)質(zhì)粒并測(cè)試其能否

3、工作;利用SP6體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)分別獲得cdh5和egfp的加帽mRNA,將該mRNA分別顯微注射入野生型斑馬魚(yú)單細(xì)胞期胚胎后,收集3.75hpf、6hpf、9hpf、18hpf、24hpf、30hpf、36hpf、48hpf和72hpf的有綠色熒光蛋白表達(dá)的cdh5過(guò)表達(dá)組、egfp對(duì)照組及空白組胚胎,提取各組標(biāo)本的總RNA,并逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA,經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)scl、lmo2、c-myb和runx1的mRNA表達(dá)量。
　

4、　結(jié)果:經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測(cè)后發(fā)現(xiàn):hoxb4實(shí)驗(yàn)組cdh5基因mRNA的表達(dá)量在24hpf和30hpf均較egfp對(duì)照組明顯升高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p﹤0.05)。構(gòu)建了cdh5-egfp-pCS2+重組質(zhì)粒,經(jīng)顯微注射有綠色熒光蛋白表達(dá);經(jīng)sp6體外轉(zhuǎn)錄出了cdh5-egfp和egfp的加帽mRNA;兩種mRNA經(jīng)顯微注射后均可以觀察到綠色熒光的表達(dá)。過(guò)表達(dá)cdh5的胚胎原始造血轉(zhuǎn)錄因子scl在6hpf、9hpf、18hpf、

5、24hpf、30hpf,lmo2在3.75hpf、6hpf、9hpf18hpf、24hpf、30hpf時(shí)均較egfp組和空白組明顯升高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p﹤0.05);成體造血轉(zhuǎn)錄因子c-myb在3.75hpf、6hpf、9hpf18hpf、24hpf、30hpf,runx16hpf、9hpf18hpf、24hpf、30hpf時(shí)均較egfp組和空白組明顯升高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p﹤0.05)。
　　結(jié)論hoxb4過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)胚胎期