Cdh5在hoxb4轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎期造血發(fā)育中的表達及對造血發(fā)育影響的研究.pdf

1、目的:同源盒基因hoxb4在促進造血發(fā)育方面有重要作用,本課題組前期對hoxb4調(diào)控造血發(fā)育的機制研究中發(fā)現(xiàn),hoxb4過表達的造血組織rap1的表達是上調(diào)的,已有的研究顯示在血管的發(fā)育中rap1可調(diào)控cdh5的表達,這些研究提示cdh5可能是hoxb4的下游靶基因,共同參與了造血發(fā)育的調(diào)控。本研究欲探討在hoxb4過表達時cdh5對造血發(fā)育的作用,以揭示cdh5參與hoxb4調(diào)控造血發(fā)育的機制。
　　方法:分別收集實驗組(Tgz

2、Lmo2:LDL-Hoxb4-egfp×TgzLmo2:Cre)和對照組(TgzLmo2:LDL-egfp×TgzLmo2:Cre)轉(zhuǎn)基因斑馬魚24hpf、30hpf的胚胎,將其制備為單細胞懸液,用流式細胞儀分選表達綠色熒光蛋白標記的成血成血管共同前體細胞;提取各組標本總RNA,并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,用實時熒光定量PCR的方法檢測各標本中cdh5基因的mRNA表達量并比較分析其差異。構(gòu)建帶egfp報告基因的cdh5全長表達質(zhì)粒并測試其能否

3、工作;利用SP6體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)分別獲得cdh5和egfp的加帽mRNA,將該mRNA分別顯微注射入野生型斑馬魚單細胞期胚胎后,收集3.75hpf、6hpf、9hpf、18hpf、24hpf、30hpf、36hpf、48hpf和72hpf的有綠色熒光蛋白表達的cdh5過表達組、egfp對照組及空白組胚胎,提取各組標本的總RNA,并逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA,經(jīng)實時熒光定量PCR檢測scl、lmo2、c-myb和runx1的mRNA表達量。
　

4、　結(jié)果:經(jīng)實時熒光定量PCR的方法檢測后發(fā)現(xiàn):hoxb4實驗組cdh5基因mRNA的表達量在24hpf和30hpf均較egfp對照組明顯升高,有統(tǒng)計學(xué)意義(p﹤0.05)。構(gòu)建了cdh5-egfp-pCS2+重組質(zhì)粒,經(jīng)顯微注射有綠色熒光蛋白表達;經(jīng)sp6體外轉(zhuǎn)錄出了cdh5-egfp和egfp的加帽mRNA;兩種mRNA經(jīng)顯微注射后均可以觀察到綠色熒光的表達。過表達cdh5的胚胎原始造血轉(zhuǎn)錄因子scl在6hpf、9hpf、18hpf、

5、24hpf、30hpf,lmo2在3.75hpf、6hpf、9hpf18hpf、24hpf、30hpf時均較egfp組和空白組明顯升高,有統(tǒng)計學(xué)意義(p﹤0.05);成體造血轉(zhuǎn)錄因子c-myb在3.75hpf、6hpf、9hpf18hpf、24hpf、30hpf,runx16hpf、9hpf18hpf、24hpf、30hpf時均較egfp組和空白組明顯升高,有統(tǒng)計學(xué)意義(p﹤0.05)。
　　結(jié)論hoxb4過表達轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎期