小鼠胚胎定向造血發(fā)育的表面標志研究.pdf

1、作為小鼠定向造血(definitive hematopoiesis)的起始,造血干細胞(hemato-poietic stem cells,HSC)的產(chǎn)生在胚胎發(fā)育時期一直廣為關注。Medvinsky等人證實第一個HSC產(chǎn)生于胚胎期10.5天(E10.5)小鼠胚內(nèi)的主動脈-性腺-中腎區(qū)(aorta-gonad-mesonephros region,AGM區(qū))。與此同時,HSC也被發(fā)現(xiàn)存在于E10.5的胚胎的頭部、臍動脈與卵黃動脈。至E1

2、1.0-E11.5時,HSC也在血管豐富的卵黃囊(yolk sac,YS)、胎盤(placenta,PL)和胎肝(fetal liver,FL)中出現(xiàn), E12.0后FL成為HSC的主要擴增位點。E17.0時HSC開始轉(zhuǎn)移至骨髓(bone marrow, BM)并大量增殖?？梢奌SC的發(fā)育在胚胎的多個位點進行,且自我更新活躍。
　　探索HSC起源的精確位點一直以來都是其發(fā)育學研究的難點之一,這是由于在第一個功能型HSC被發(fā)現(xiàn)的同時

3、,胚胎循環(huán)系統(tǒng)已經(jīng)建立,因而無法得知HSC是否產(chǎn)生于單一且獨立的原發(fā)位點。而且,至今尚未發(fā)現(xiàn)有任何單一標志能特異性富集胚胎期的HSC。這也使尋找其精確的原發(fā)位點變得異常困難。
　　本研究的第一部分,主要考察了Flk-1分子在胚胎期10.5天(E10.5)的AGM區(qū)不同類型造血前體細胞的表達情況。流式細胞學分析發(fā)現(xiàn)低于10％的Flk-1+細胞與CD41、CD45/Ter119有共表達。繼而分選出CD31+CD45-Ter119-Fl

4、k-1+CD41+(R1,代表不成熟的造血前體細胞)和CD31+CD45-Ter119-Flk-1+CD41-(R2,代表內(nèi)皮細胞)兩群細胞,利用造血集落培養(yǎng)和OP9共培養(yǎng)體系分別考察其體外的髓系與淋系潛能。結(jié)果表明:僅R1組細胞能在造血集落培養(yǎng)體系中形成典型的造血集落;但與OP9共培養(yǎng)7-9天后,兩組細胞均能產(chǎn)生豐富的造血前體細胞(CD45+c-Kit+)、髓系細胞(Gr-1+/Mac-1+)、紅細胞(Ter119+)和B淋巴細胞(C

5、D19+)。上述結(jié)果表明:E10.5的小鼠胚胎AGM區(qū),Flk-1仍然在幼稚的造血前體細胞以及更早期的生血內(nèi)皮細胞表達。但是,此時的造血干細胞前體和造血干細胞是否表達Flk-1仍需通過體內(nèi)功能實驗明確。
　　本研究的第二部分,主要考察了CD47分子在E10.0-E12.5相關造血位點不同類型造血細胞的表達情況。流式分析顯示:E10.5AGM/YS/循環(huán)血、E11.5AGM/YS/PL和E12.5循環(huán)血中的活細胞中分別有1.0%/1

6、3.3%/2.1%、1.4%/13.4%/13.6%和0.9%的細胞表達CD47。流式分選出E10.0AGM/卵黃囊/循環(huán)血中的CD47+與CD47-兩群細胞后,應用體外的CFU-C實驗檢測兩群細胞的體外髓系潛能,培養(yǎng)7-9天后發(fā)現(xiàn)E10.0AGM/YS/循環(huán)血中僅CD47+細胞群能產(chǎn)生典型的造血集落(CFU-C)。說明在CFU-C培養(yǎng)體系中,僅CD47+群中含有髓系祖細胞。隨后我們利用流式細胞術分選出E10.5AGM區(qū)內(nèi)的c-Kit+

7、CD47+(R1)與c-Kit+CD47-(R2)兩群細胞,利用OP9共培養(yǎng)體系檢測上述兩群細胞的體外造血潛能,培養(yǎng)7-9天發(fā)現(xiàn)兩群均能在OP9共培養(yǎng)體系下形成一定比例的CD45+c-Kit+細胞(造血細胞)、Ter119+細胞(紅細胞)、Gr-1+/Mac-1+細胞(髓系祖細胞)、B220+細胞(B淋巴細胞或前體),這表明:在OP9共培養(yǎng)體系下,E10.5AGM區(qū)內(nèi)CD47+細胞與CD47-細胞均具有一定的造血潛能。為明確HSC表面是

8、否表達CD47,我們同樣利用流式細胞術將E11.5AGM區(qū)、卵黃囊和胎盤的細胞分選為c-Kit+CD47+(R1)與c-Kit+CD47-(R2)兩群細胞。隨后的移植實驗結(jié)果顯示僅R1群能產(chǎn)生造血重建。這表明E11.5AGM、卵黃囊和胎盤中的HSC均表達CD47,從而進一步證實CD47能富集此時AGM區(qū)、卵黃囊和胎盤中所有的HSC。有趣的是,當我們將E12.5循環(huán)血中的R1群分選至c-Kit+CD47high與c-Kit+CD47low