WIP1對小鼠胚胎造血發(fā)育調控的異質性研究.pdf

1、造血干細胞（hematopoietic stem cell,HSC）發(fā)育調控是近年來實驗血液學、再生醫(yī)學、干細胞生物學和免疫學等多學科交叉研究的重點。造血干細胞移植可以給很多惡性血液病、淋巴瘤等其他某些實體腫瘤患者帶來很好的療效。造血干細胞來源有限且無法在體外大量有效擴增是限制其臨床應用的主要瓶頸。深入探究造血干細胞發(fā)育規(guī)律將有助于體外誘導擴增可供使用的造血干細胞。然而，由于造血干細胞的發(fā)育涉及多個組織多個精密的分化階段，對其中的相關機

2、理探討頗具科學意義。
　　造血干細胞可以在受體內長期多譜系重建受損的造血系統(tǒng)。然而越來越多的研究表明每個造血干細胞都有各自不同的特征，具有異質性，這些不同體現在分化的譜系偏向、細胞增殖能力、細胞周期、自我更新能力的強弱、對信號調控的反應等多個方面。
　　Wild-type（WT）p53-induced phosphatase1（WIP1）是由Ppm1d基因編碼的絲氨酸、蘇氨酸磷酸酶，與PP2C磷酸酶家族成員具有高度的同源性。

3、WIP1廣泛分布于成體和胚胎組織，它具有多種生理功能，參與調控胸腺的穩(wěn)態(tài)維持，參與早期T、B細胞和中性粒細胞的發(fā)育和成熟。WIP1在成體HSC中高表達，調控成體HSC的穩(wěn)態(tài)維持和分化。Wip1敲除小鼠（Wip1-/-，KO）的骨髓、外周血、脾臟的B淋巴細胞數目較野生型（Wip1+/+，WT）明顯減少，B細胞內p53持續(xù)激活，導致凋亡水平上調。Wip1-/-小鼠成體骨髓 HSC表現衰老的表型，包括造血干細胞池擴大，造血重建活力減低，而刪除

4、 p53可以挽救多系重建缺陷，但是不影響造血干細胞池的擴大，后者被證明與mTORC1介導的HSC增殖相關。然而，WIP1是否調控胚胎期造血干細胞的發(fā)育及其調控特點仍未知。本課題旨在利用Wip1基因敲除小鼠對WIP1在胚胎造血發(fā)育中的作用及其調控規(guī)律進行研究。
　　首先，我們對Wip1缺失對胚胎期不同造血位點 HSC發(fā)育的影響進行研究，包括胎肝、AGM區(qū)、卵黃囊、胎盤、頭部的 HSC的數目和功能。前期研究中發(fā)現，Wip1缺失小鼠胚胎

5、大體外觀較野生型小，胎肝發(fā)育體積較野生型小，Wip1缺失胎肝造血干細胞發(fā)育異常，表型HSC數目下降，HSC體內移植功能下降。AGM區(qū)作為HSC產生和成熟的重要位點，我們通過直接移植實驗證明Wip1缺失胚胎AGM區(qū)幾乎沒有正常功能型的HSC。Wip1缺失卵黃囊、胎盤和頭部直接移植，發(fā)現均有重建，但是較野生型比HSC的數目和功能有不同程度的受損，受損程度介乎胎肝和AGM區(qū)之間。因既往研究表明WIP1與增殖、細胞周期、凋亡相關，于是我們考察了

6、Wip1-/-E12.5胎肝HSC的增殖、細胞周期和凋亡。取Wip1+/+和Wip1-/-E12.5胎肝的細胞，分別標記HSC的同時標記CD168考察增殖，標記Ki67/7-AAD考察周期，標記AnnexinV/7-AAD考察凋亡。和Wip1+/+相比，Wip1-/-HSC在增殖和周期上表現更活躍，凋亡有所增多。
　　接下來我們考察Wip1缺失對小鼠胚胎AGM區(qū)pre-HSC的產生及功能的調控作用，主要分為體外體內兩部分。體外主要

7、是考察pre-HSC與基質細胞OP9-DL1共孵育移植過程中應用WIP1抑制劑CCT的影響。我們想先排除WIP1抑制劑對基質細胞的抑制作用，分別用DMSO（作對照）和CCT作用基質細胞OP9-DL148小時，考察OP9-DL1表面干性標志和其他造血相關標志包括Sca-1、CD44、CD31、CD45的變化情況，同時檢測其增殖、凋亡，以上均未發(fā)現明顯差異，說明WIP1抑制劑對基質細胞的功能狀態(tài)無抑制?？疾霿IP1抑制劑CCT對單個pre-

8、HSC體外孵育增殖的影響。流式分選E11.5 WT小鼠胚胎AGM單個的T1 pre-HSC（CD31+CD41lowCD45-c-Kit+CD201high）和T2pre-HSC（CD31+CD45+c-Kit+201high）體外孵育6天，實驗組加CCT，對照組加DMSO，計數形成大、中、小型簇的數目。結果顯示，無論對于T1 pre-HSC還是T2 pre-HSC，與對照組比CCT在體外均能明顯抑制大型簇的形成，總體上對于T1 pre

9、-HSC抑制更為明顯，形成的小型簇比例更多。隨后考察WIP1抑制劑CCT對T1 pre-HSC、T2 pre-HSC孵育移植的功能影響。我們分選出野生型(或CD45.1/CD45.2)胚胎的E11 AGM區(qū)包括T1 pre-HSC（CD31+CD41+CD45-）和T2 pre-HSC（CD31+CD45+）的群體在體外孵育，孵育過程中用CCT處理（對照組用DMSO），孵育6天后移植，移植后1-4個月檢測受體外周血嵌合率。具體移植重建結

10、果：T1 pre-HSC對照組重建為6/7，實驗組為0/7；T2 pre-HSC對照組為7/7，實驗組為3/6。結果表明，CCT會嚴重抑制T1 pre-HSC、T2 pre-HSC的體外孵育成熟，而對T1 pre-HSC較T2 pre-HSC的抑制更為明顯。
　　隨后將Wip1-/-小鼠胚胎AGM區(qū)T1 pre-HSC、T2 pre-HSC孵育移植。我們將Wip1+/-與Wip1+/-小鼠交配，獲得WT、HT、KO三種基因型的胚胎

11、，分離E11 AGM區(qū)，流式分選包括T1 pre-HSC和T2 pre-HSC群體體外與OP9-DL1共培養(yǎng)6天后移植，采集外周血檢測重建情況。通過移植后1-6個月外周血的數據采集，我們發(fā)現Wip1-/-胚胎T1 pre-HSC孵育移植可以檢測到重建，且重建比例和嵌合率與野生型相近，說明T1 pre-HSC體外可以發(fā)育為功能基本正常的造血干細胞；而T2 pre-HSC的孵育移植外周血嵌合率較野生型明顯下降。上述結果表明，生理條件下，Wi

12、p1缺失胚胎AGM區(qū)可以產生功能較正常的T1 pre-HSC，體外孵育可以獲得功能正常的HSC，但是WIP1體內持續(xù)缺失一旦形成T2 pre-HSC，孵育移植則有明顯的功能缺陷。
　　為了更充分的比較Wip1缺失與否對胚胎期的各位點的造血發(fā)育產生的影響，我們將目光放在了循環(huán)血上，而循環(huán)血中是否存在pre-HSC仍是未解之謎。于是我們對野生型小鼠E10(31-40sp)、E11(41-44sp)胚胎循環(huán)血細胞進行類似AGM區(qū)pre-

13、HSC的分析和分選孵育移植實驗，分別進行了4次、7次獨立實驗，分別檢測了25只、80只受體，結果均未檢測到重建。在現有的實驗基礎上，未能從功能移植實驗檢測到循環(huán)血pre-HSC。
　　綜合以上數據，我們的工作揭示了WIP1在小鼠胚胎重要的造血發(fā)育位點包括胎肝、AGM區(qū)、卵黃囊、胎盤、頭部對造血干細胞發(fā)育調控都發(fā)揮著不同程度的重要作用，其中對AGM區(qū)HSC的形成及功能至關重要，對胎肝和卵黃囊、胎盤、頭部影響較AGM不同程度減弱。我們

14、首次發(fā)現WIP1對造血干細胞前體的調控作用，尤其是對T1 pre-HSC和T2 pre-HSC具有差異性調控作用，WIP1缺失不影響T1 pre-HSC形成及功能，但是WIP1持續(xù)缺失對于T1 pre-HSC的進一步成熟為HSC具有嚴重抑制作用。WIP1抑制劑CCT會嚴重抑制T1 pre-HSC、T2 pre-HSC的體外孵育成熟，而對T1 pre-HSC較T2 pre-HSC的抑制更為明顯。關于WIP1對造血干細胞發(fā)育調控的相關研究使