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文檔簡介
1、目的和意義：Notch1基因是Notch基因家族的重要成員之一,在胚胎發(fā)育、血細胞發(fā)育以及腫瘤形成等多個病理生理過程中發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)超過60％的T-ALL患者體內(nèi)存在Notch1基因突變，但具體的機制并不明確。本課題擬在Tg(fli1:EGFP)斑馬魚中，轉入淋巴細胞特異性rag2啟動子驅動的人源性截短型Notch1基因（ICN1），并在下游連接紅色熒光蛋白（RFP），從中篩選并鑒定出發(fā)生T-ALL的斑馬魚，建立穩(wěn)定傳代紅綠雙熒光示
2、蹤的Notch1轉基因斑馬魚疾病模型以研究Notch1基因對淋系造血功能及血管新生的影響，為深入探討 Notch1在促進T-ALL發(fā)生中的調(diào)控機制以及利用這種疾病模型進行高通量的活體藥物篩選提供了研究平臺。
實驗方法和結果：構建rag2-ICN1-RFP重組質(zhì)粒，顯微注射到單細胞期的斑馬魚胚胎，利用熒光體視顯微鏡篩選出F0代，并建立穩(wěn)定傳代的轉基因魚系至F2代。通過熒光體視顯微鏡、RT-PCR、Western blotting
3、驗證ICN1基因和蛋白的表達，并利用流式細胞術、外周血涂片、熒光實時定量PCR(RFQ-PCR)等方法鑒定轉基因斑馬魚疾病表型的變化。結果在867條顯微注射重組質(zhì)粒的斑馬魚中，鑒定發(fā)現(xiàn)有20條（2.3%）轉基因陽性斑馬魚，其中雄魚9條，雌魚11條，為F0代轉基因斑馬魚。流式細胞術和外周血涂片結果顯示轉基因斑馬魚與對照組相比紅細胞比例顯著減少，淋巴細胞比例明顯增高。RFQ-PCR顯示與對照組相比，轉基因斑馬魚F1和F2代淋系關鍵造血調(diào)控因
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