大腸桿菌嚴重感染引起斑馬魚幼魚髓系應急造血機制的研究.pdf

1、炎癥是十分常見而又重要的基本病理過程，當在感染等應急條件下，機體需要快速生成大量免疫細胞來應對這一挑戰(zhàn)，而生成大量免疫細胞的過程則被稱為應急性造血。但是免疫細胞的應急性產(chǎn)生以及與病原體相互作用的動態(tài)過程仍不被人們熟知。而且，作為所有血液細胞來源的造血干祖細胞（HSPC）是否在免疫過程發(fā)揮作用，這仍沒有非常明確的答案。
　　脊椎動物系統(tǒng)性感染病原體（例如細菌）時會出現(xiàn)一種類似菌血癥的癥狀。此時，血液細胞特別是白細胞會立即做出反應，大

2、量增生以消滅病原體。在此過程中大量細胞因子發(fā)揮重要作用，例如Irf8、Pu.1。髓系白細胞包括單核細胞（巨噬細胞）和多形核吞噬細胞（粒細胞），基于這兩種細胞非特異性的吞噬能力，他們往往作為抵御外界病原體入侵機體的第一道防線。粒細胞是外周血的重要組成部分，它們在抵御外來細菌時發(fā)揮重要作用，基于此，粒細胞會大量消耗，但隨后會大量擴增，而這就是應急性粒細胞生成，是清除病原體過程中不可或缺的免疫反應部分。巨噬細胞因其強大的吞噬消化能力而成為清除

3、病原體以及死細胞的重要成員，特別是在緩解感染引起的炎癥方便起重要作用。
　　近年來，斑馬魚（Danio rerio），這種原產(chǎn)于喜馬拉雅山脈東南區(qū)域的觀賞用熱帶淡水魚，在過去的幾十年中，因其繁殖快、易于飼養(yǎng)、身體透明、體積小的巨大優(yōu)勢，正作為一種脊椎模式動物漸漸被應用于科學研究。本研究中，通過靜脈顯微注射，使受精后2天的斑馬魚系統(tǒng)性感染大腸桿菌（E.coli）以引起應急性造血。感染條件下，巨噬細胞和粒細胞會迅速反應吞噬消滅微生物。

4、巨噬細胞基本執(zhí)行吞噬行為，但粒細胞會依據(jù)不同的感染方式以及不同的微生物而產(chǎn)生不同的免疫反應。
　　眾所周知,血液細胞是一個大家族,主要有3大系,即紅系（由紅細胞、血小板組成），髓系（由巨噬細胞和粒細胞構成）以及淋系（由T、B淋巴細胞組成）,整個血液細胞家族最初來源于一個共同的祖細胞即源于中胚層的造血干細胞(HSC)。造血干細胞（HSC）是一類特殊的靜止期細胞，它能夠自我更新以維持體內(nèi)平衡，也能夠在機體需要時分化成各種細胞類型。我們

5、知道，髓系細胞的大量擴增會引起其前體細胞的活化，但是否HSC也會被活化參與免疫反應呢，我們不得而知。因為我們是通過不同的細胞表面的血系標記物來區(qū)分不同的細胞，但是HSC的標記物尚未確定，所以很難得到真正的HSC，但是我們可以通過標記物得到造血干/祖細胞（HSPC）。許多研究已經(jīng)證明HSPC在病原體或相關物質(zhì)引起的感染情況下會擴增，例如脂多糖（LPS）。但是也有研究證明感染條件下HSPC并不會發(fā)生反應甚至在有些情況下會數(shù)目降低。所以，不同

6、病原體感染不同宿主引起HSPC不同的反應，HSPC的變化應視具體情況而定。
　　高通量測序技術又稱“下一代”測序技術，它的出現(xiàn)使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進行細致全貌的分析成為可能，所以又被稱為深度測序。為了更進一步探索感染后幼魚機體RNA水平的變化情況，我們進行了轉(zhuǎn)錄組測序。結(jié)果顯示感染后大量的基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄水平的變化，而這種變化表明感染后機體的免疫應答先是受到抑制隨后啟動，直至完成對細菌的清理。該結(jié)果與細胞水平髓系細胞先被消耗

7、隨后大量擴增的結(jié)果相符合。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)我們選取了改變較明顯且是血液發(fā)育至關重要的調(diào)控因子的Pu.1作為重點研究對象。
　　在髓系前體細胞向巨噬細胞或是粒細胞的分化過程中。Pu.1表達水平的高低是細胞命運的決定因素。進一步的研究表明，Pu.1在調(diào)控淋系及髓系細胞的分化過程有一個劑量依賴的關系，Pu.1高表達會促進髓系，尤其是巨噬細胞的生成，而低表達則促進B淋巴細胞的發(fā)育。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在pu.1突變體感染E.coli后，髓系吞噬細

8、胞及其前體細胞依然會大量擴增，但跟野生型相比，除巨噬細胞增加水平高于野生型外，粒細胞和髓系前體細胞的增加水平都弱于野生型，而且E.coli較長時間存在于血管以及動靜脈之間。在pu.1突變體或是pu.1 MO幼魚中感染E.coli后，斑馬魚幼魚的HSPC是明顯減少的，其原因是在 pu.1 MO幼魚中cmyb+HSPC凋亡的細胞明顯增多，而其增殖細胞沒有發(fā)生變化。由此可見，雖然Pu.1在髓系應急性造血中沒有起到至關重要的作用，但對髓系細胞的

9、成熟以及維持HSPC的體內(nèi)平衡卻是必不可少的。
　　在本研究中，我們通過靜脈注射非致死的細菌（大腸桿菌，E.coli）引起系統(tǒng)性感染，進而仔細觀察CHT部位的吞噬細胞（巨噬細胞和粒細胞）以及他們的前體細胞甚至HSPC的變化情況。結(jié)果顯示，髓系吞噬細胞會立即做出反應來應對E.coli，在注射后6小時（6hpi）吞噬細胞會有所消耗，但隨后會逐漸增多，在注射后2-4天（2-4dpi）會達到峰值，然后恢復至生理水平。與此同時，免疫反應相關