納米銀引起斑馬魚胚胎色素減退的分子機(jī)制.pdf

1、納米銀有著廣譜的抑菌特性，被廣泛的應(yīng)用于人類的生產(chǎn)和生活中，而納米銀生物安全性評估的工作還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。最近有研究發(fā)現(xiàn)納米銀能夠抑制脊椎動物紅系細(xì)胞的形成和分化，引起脊柱彎曲和心率失常等現(xiàn)象。但是在模式生物中研究納米銀影響神經(jīng)脊發(fā)育和色素細(xì)胞生成的不多。在本實驗中，選取模式生物斑馬魚（Danio rerio）作為研究的對象。首先通過基因芯片技術(shù)和生物信息學(xué)手段篩選出納米銀暴露斑馬魚胚胎中和色素形成相關(guān)的表達(dá)下調(diào)的基因，接著利用qRT-PCR

2、技術(shù)和整體原位雜交技術(shù)驗證基因表達(dá)下調(diào)的結(jié)果。然后利用黑色素生成激活劑棕櫚酸和雙丁酰環(huán)磷腺苷來營救（恢復(fù)）納米銀暴露組胚胎色素形成相關(guān)基因的表達(dá)下調(diào)，探究色素減退的分子機(jī)制。最后，利用銀螯合劑L-半胱氨酸來區(qū)分納米銀生物學(xué)效應(yīng)的來源。主要結(jié)果如下:
　　1.納米銀引起斑馬魚胚胎色素減退
　　納米銀組胚胎相對于上清液組胚胎和野生型組胚胎出現(xiàn)了色素減退的現(xiàn)象，黑色素細(xì)胞顯著的減少和黃色素細(xì)胞略微的減少。
　　2.納米銀抑制

3、黑色素細(xì)胞和黃色素細(xì)胞相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄
　　通過基因芯片技術(shù)和生物信息學(xué)手段篩選出的16個和斑馬魚色素形成相關(guān)的基因呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)。進(jìn)一步通過qRT-PCR技術(shù)檢測了納米銀暴露組胚胎中黑色素細(xì)胞形成相關(guān)基因mitfa、tyrp1b、oca2、dct，黃色素細(xì)胞形成相關(guān)基因gch2、aox5，銀色素細(xì)胞形成相關(guān)基因csf1b的表達(dá)量。和對照組相比，納米銀組和銀離子組胚胎中基因mitfa、tyrp1b、oca2、dct、gch2和aox5

4、均出現(xiàn)顯著性的表達(dá)下調(diào)，但是基因csf1b卻出現(xiàn)了顯著性的上調(diào)表達(dá)。此外，本研究利用整體原位雜交技術(shù)檢測了納米銀暴露組胚胎中上述相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平和時空分布。和野生型組胚胎相比，納米銀暴露組胚胎和銀離子組胚胎中黑色素細(xì)胞相關(guān)基因dct和tyrp1b均出現(xiàn)顯著性的表達(dá)下調(diào)。
　　3.納米銀主要通過釋放銀離子影響神經(jīng)脊的形成和色素細(xì)胞的形成
　　本實驗首先檢測了不同濃度的棕櫚酸和雙丁酰環(huán)腺苷酸對胚胎色素細(xì)胞生成相關(guān)基因表達(dá)量的影

5、響。最終選取了10μM雙丁酰環(huán)腺苷酸和1μM棕櫚酸進(jìn)行接下來的聯(lián)合暴露實驗。納米銀暴露組和銀離子組胚胎中基因crestin、 mitfa、dct和gch2的表達(dá)均受到顯著性的抑制，但是在添加了雙丁酰環(huán)腺苷酸或棕櫚酸中后上述基因恢復(fù)到正常水平甚至更高的水平。L-半胱氨酸能夠鰲合銀，本研究發(fā)現(xiàn)納米銀組胚胎中出現(xiàn)了黑色素細(xì)胞和黃色素細(xì)胞的減少，然而，在納米銀和L-半胱氨酸聯(lián)合暴露組胚胎中黃色素細(xì)胞和黑色素細(xì)胞又開始增多。通過整體原位雜交技術(shù)檢