納米銀的細(xì)胞毒性效應(yīng)及其機制初探.pdf

1、由于具有良好的抑菌殺菌活性、光電催化和超導(dǎo)性能，納米銀己經(jīng)成為目前市場上應(yīng)用最廣泛的金屬納米材料，商品化產(chǎn)品幾乎無處不在。與蓬勃發(fā)展的納米物質(zhì)和納米技術(shù)相比，全球各國政府卻面臨著納米物質(zhì)和納米技術(shù)政策、法規(guī)和監(jiān)管方面的諸多挑戰(zhàn)?！叭绾卧谟行ПO(jiān)管納米物質(zhì)和納米技術(shù)，確保公眾安全、健康的前提下，有效促進納米物質(zhì)和納米技術(shù)持續(xù)、穩(wěn)定地增長?”成為政府監(jiān)管部門必須面對的現(xiàn)實難題。本課題通過體外、體內(nèi)不同實驗技術(shù)組合較系統(tǒng)地研究納米銀的細(xì)胞毒性效

2、應(yīng)并探討其機制。主要研究結(jié)果如下：
　　采用粒徑范圍在1~30 nm的納米銀顆粒，其中3~10 nm粒度范圍占98.7％。XRD分析表明，擁有單質(zhì)銀的特征峰波長為2θ=38.24°。TEM成像顯示納米銀水相分散均勻、無明顯的團聚。此外，測定濃度為100和1000μg/mL的納米銀-去離子水分散體的平均ζ電位分別為：(-37.83±3.2)和(-44.43±0.29) mV。表征數(shù)據(jù)表明粒徑分布較窄，并且在水相中分散均勻，有利于生物

3、效應(yīng)及毒性作用研究。
　　以80.0、40.0、20.0、10.0、5.0、2.5μg/ml等6個濃度的納米銀處理 L5178Y/tk+/--3.7.2C細(xì)胞3 h，換入新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)2天，相對懸浮增殖率隨濃度的增加而降低，在5.0μg/ml時已達到陰性對照組的11.42%。然后以5.0、2.5、1.25和0.63μg/ml處理細(xì)胞3 h，tk基因位點突變能力呈濃度依賴性升高，與陰性對照組差異顯著（P<0.05）。同時，小集落（S

4、C）比例較陰性對照組均有顯著提升（P<0.01）。以80.0、40.0、20.0、10.0、5.0、2.5μg/ml等6個濃度的納米銀處理CHL細(xì)胞24 h，隨著染毒濃度的升高，細(xì)胞活力呈下降趨勢，染毒濃度為40.0μg/ml時細(xì)胞活力下降至7.52%計算得到IC50值為21.68μg/ml。隨后以11.0、22.0和44.0μg/ml染毒處理24 h，染色體畸變分析表明，納米銀各濃度組誘導(dǎo)染色體結(jié)構(gòu)畸變均大于5%，中高濃度組多倍體發(fā)生

5、率達到溶劑對照組的10倍以上（P<0.01）。
　　納米銀在5.0、2.5、1.25、0.63mg/kg劑量下單次尾靜脈注射后采用堿性彗星電泳方法檢測了對SD大鼠肝臟細(xì)胞DNA損傷情況。5.0 mg/kg組給藥后10min內(nèi)死亡2只大鼠，24內(nèi)死亡數(shù)增加至3只，未獲得具有統(tǒng)計學(xué)意義的數(shù)據(jù)。納米銀2.5 mg/kg劑量組尾部DNA含量和Olive尾距與溶劑對照組相比均有顯著性差異（P<0.05）。采用流式細(xì)胞術(shù)分析了給藥后外周血微核

6、發(fā)生率，除5.0 mg/kg組外，其余各組納米銀誘發(fā)外周血網(wǎng)織紅細(xì)胞微核發(fā)生率與陰性組相比均有顯著性差異（P<0.05），并且與暴露劑量呈正相關(guān)（Pearson’s r=0.98，P<0.05）。
　　采用11.0、22.0和44.0μg/mL3個納米銀濃度處理CHL細(xì)胞24 h，利用JC-1探針分析細(xì)胞膜電位變化。結(jié)果表明膜電位與納米銀染毒濃度呈負(fù)相關(guān)，與陰性對照組差異顯著（P<0.05）。經(jīng)22.0μg/mL納米銀染毒后3、6

7、、12、24和48 h后，利用PI染色分析細(xì)胞周期變化并計算細(xì)胞增殖指數(shù)；Annexin V-FITC和PI雙染檢測細(xì)胞凋亡和壞死發(fā)生率，同時觀察細(xì)胞染毒后形態(tài)變化，記錄前向角散射（FSC）和側(cè)向角散射（SSC）信號。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)：納米銀處理組SSC信號則均略有增強，24 h時約為對照組的2.5倍，同時細(xì)胞形態(tài)也發(fā)生了明顯變化；CHL細(xì)胞周期分析表明，溶劑對照組在24 h和48 h時 G0/G1期比例明顯升高，48h S期比例則明顯下降

8、（P<0.01），相同的時間點納米銀處理組也呈現(xiàn)相同變化規(guī)律，但幅度明顯低于溶劑對照組（P<0.01）；染毒各時間點納米銀處理組G2/M期細(xì)胞比例均顯著高于對照組（約2~5倍）（P<0.01），表明納米銀處理影響了CHL細(xì)胞的細(xì)胞周期，并使CHL細(xì)胞被捕獲于G2/M期。溶劑對照組細(xì)胞增殖指數(shù)在24 h和48 h均明顯下降，納米銀處理組細(xì)胞增殖指數(shù)在上述兩個時間點也略有下降，下降幅度遠低于對照組。檢測CHL細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)，24 h以內(nèi)納米銀

9、處理組凋亡和壞死細(xì)胞比例與對照組相比無明顯差異（P>0.05）；染毒24 h凋亡細(xì)胞急劇增加——早期凋亡細(xì)胞（Annexin V-FITC+，PI-）、晚期凋亡細(xì)胞（Annexin V-FITC+，PI+）均增加3倍左右，壞死細(xì)胞（Annexin V-FITC-，PI+）比例也明顯上升，與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；染毒至48 h早、晚期凋亡發(fā)生率較24 h略有下降，但與對照組比較差異仍有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），壞

10、死細(xì)胞比例則持續(xù)上升，約為24 h時的5.7倍，與對照組比較差異顯著（P<0.01）。
　　以5.00、2.50、1.25和0.625μg/ml納米銀處理L5178Y細(xì)胞，用DCFH-DA法測定細(xì)胞內(nèi) ROS水平，裂解細(xì)胞后 FRAP法測定總抗氧化能力同時檢測脂質(zhì)過氧化（MDA）水平。結(jié)果表明納米銀處理組細(xì)胞裂解液的總抗氧化能力顯著低于陰性對照組，MDA含量顯著增加，而ROS未見明顯變化。
　　綜上所述，所用粒徑的納米銀誘發(fā)