藤黃酸藥物聯合的細胞毒性效應及其機制.pdf

1、背景與目的：
　　藤黃酸（Gambogic acid，GA）是天然存在于藤黃科植物藤黃樹(Garcinia hanburyi Hook. f.)的干燥樹脂。臨床研究證明，它對乳腺癌、淋巴瘤、皮膚癌、胃癌均有一定療效，而對正常造血系統和白細胞無影響。藤黃酸可以促進細胞凋亡、抑制血管生成、抑制端粒酶活性、抑制核膜孔蛋白表達、誘導細胞周期在G2/M期停滯，激活T淋巴細胞對腫瘤細胞凋亡的誘導，是一個多靶點抗腫瘤藥物。實驗室的前期結果發(fā)現藤

2、黃酸能夠抑制腫瘤細胞的蛋白酶體活性，本實驗在前期結果的基礎上進一步探討藤黃酸聯合不同藥物對正常細胞和腫瘤細胞的細胞效應，為藤黃酸的臨床應用提供試驗依據。
　　方法與結果：
　　1、大鼠骨髓間充質干細胞(Rat mesenchymal stem cells，rMSCs)體外分離、培養(yǎng)、擴增和鑒定
　　SD乳鼠頸椎脫臼致死后，雙側股骨，暴露骨髓腔，用含血清的培養(yǎng)液反復沖洗骨髓腔，收集骨髓細胞懸液到離心管中，低速離心，棄去上

3、清，用含10％FBS的低糖DMEM培養(yǎng)液制成單細胞懸液后接種于T25培養(yǎng)瓶中。10天左右待細胞生長匯合，用胰酶消化后按1：3的比例進行傳代。約3代后可得到比較純凈的間充質干細胞。為了檢驗間充質干細胞的多向分化潛能，按照文獻所述[18]誘導成脂。選擇P4-P10代rMSCs,接種于6孔細胞培養(yǎng)板,24小時后,在誘導組的完全培養(yǎng)液中加入下列誘導劑(1μM地塞米松、5μg/ml胰島素、0.5 mM IBMX、50μM吲哚美辛)誘導10天后，在

4、倒置顯微鏡下可見胞漿內含有數量不等、大小不一、強折光性脂滴的脂肪細胞，有的脂滴融合成較大的脂泡。
　　2、藤黃酸聯合蛋白酶體抑制劑MG132對大鼠骨髓間充質干細胞(rMSCs)的影響
　　選擇大鼠骨髓間充質干細胞為研究對象，按一定數量接種于96孔板中，24小時后待細胞單層融合，棄掉上清，加入含不同濃度的藤黃酸（0.25μM、、0.5μM、1μM），MG132（0.25μM、0.5μM、1μM）新鮮培養(yǎng)基，作用48小時。加入M

5、TS(CellTiter96 AQ MTS Reagent Powder)試劑，每100μL體積內加入20μL，37度恒溫培養(yǎng)箱中孵育1-3小時，用多功能酶標儀檢查光密度值,并計算聯合指數(Combination index,CI)。發(fā)現1μM藤黃酸與1μM MG132作聯合可抑制rMSC50%細胞活性，并呈濃度依賴關系，二者聯合指數CI<1,說明兩藥應用有協同作用。
　　3、藤黃酸聯合蛋白酶體抑制劑MG262對人肝癌細胞的細胞（

6、HepG2）影響
　　選擇人肝癌細胞的細胞（HepG2）為研究對象，按一定數量接種于96孔板中，24小時后待細胞單層融合，棄掉上清，加入不同濃度的藤黃酸（0.25μM、、0.5μM），MG262（0.025μM、0.05μM、0.1μM、0.2μM），作用48小時。加入MTS試劑，每100μL體積內加入20μL，37度恒溫培養(yǎng)箱中孵育1-3小時，用多功能酶標儀檢查光密度值,并計算聯合指數 CI。發(fā)現藤黃酸與 MG262聯合作用可抑

7、制HepG2細胞活性，并呈濃度依賴關系，二者聯合指數CI<1,說明兩藥應用有協同作用。
　　4、藤黃酸聯合蛋白酶體抑制劑MG132對大鼠骨髓間充質干細胞(rMSCs)內泛素化蛋白質的影響
　　試驗選擇大鼠骨髓間充質干細胞(rMSCs)，加入不同濃度的藤黃酸（0.25μM、0.5μM），并且與MG132（0.25μM、0.5μM）聯合。作用12小時收集細胞，裂解細胞，抽提總蛋白進行Western blot蛋白測定。SDS-PA

8、GE電泳根據論文所述方法，采用ECL-Plus測定試劑及Kodak公司生產的X光曝光成像系統對實驗結果進行采集。結果Ub的聚集與不同濃度的藤黃酸作用呈濃度依賴關系，藥物聯合之后 Caspase9出現降解帶。表明藤黃酸誘導細胞凋亡與蛋白酶體的關系有關，且可以激活Caspase9蛋白分子。
　　5、藤黃酸聯合銅離子對人乳腺癌細胞MCF-7細胞的作用
　　采用人乳腺癌細胞系MCF-7細胞為試驗對象，設立藤黃酸單獨組（0.75μM、

9、1μM、1.5μM、2μM），Cu單獨組（10μM、20μM、30μM），Cu20μM+藤黃酸（0.75μM、1μM、1.5μM、2μM）聯合組，加藥48小時用Annexin V/FITC雙染試劑盒標記，在37度培養(yǎng)箱中孵育15-30min，在熒光倒置顯微鏡下觀察不同凋亡時期的細胞，隨著濃度增加細胞出現變圓，聯合組貼壁細胞大部分浮起，說明藤黃酸與銅聯合能誘導腫瘤細胞死亡，呈濃度依賴關系。同樣的條件下，用MTS法檢測細胞生長抑制，結果發(fā)現

10、藤黃酸和Cu聯合能抑制細胞活力，呈濃度依賴關系，計算聯合指數均<1,具有協同效應。
　　6、藤黃酸聯合銅離子對人肝癌細胞SMMC-7721細胞作用
　　采用人肝癌細胞系SMMC-7721為試驗對象，設立藤黃酸單獨組（0.75μM、1μM、1.5μM、2μM），Cu單獨組（10μM、20μM、30μM），Cu20μM+藤黃酸（0.75μM、1μM、1.5μM、2μM）聯合組，加藥48小時用Annexin V/FITC雙染試劑盒

11、標記，在37度培養(yǎng)箱中孵育15-30min，在熒光倒置顯微鏡下觀察不同凋亡時期的細胞，藤黃酸與銅聯合能誘導腫瘤細胞死亡，呈濃度依賴關系。同樣的條件下，用MTS法檢測細胞生長抑制，結果發(fā)現1.5μM藤黃酸和20μMCu聯合能抑制細胞50%活力，呈濃度依賴關系，計算聯合指數具有協同效應。
　　7、藤黃酸聯合銅離子對體內外蛋白酶體活性的影響
　?。?）藤黃酸聯合銅離子對體外蛋白酶體活性的影響
　　采用培養(yǎng)的人乳腺癌細胞MCF

12、-7為研究對象，種于60mm培養(yǎng)皿中，待將MCF-7細胞80%-90%融合時倒掉原培養(yǎng)基，裂解細胞抽提全蛋白，蛋白濃度測定同上，調至1.0μg將不同濃度的銅（10μM、20μM、30μM）和15μM的藤黃酸各5μL混于490μLPH值為7.4的HCl中置于37度恒溫箱中反應6小時。在96孔板中加入10μL/10μg蛋白，每個樣本設2個復孔。然后每孔分別加入180μL Tris-HCl（PH7.4）（含2μL LSUC-LLVY-AMC）

13、和10μL已孵育好的藥物。將96孔板置于37度恒溫水浴箱孵育120min后用熒光分光光度計測定熒光值。低濃度藥物作用下，酶活性基本無變化，僅在Cu1.0uM與GA0.75uM時酶活性略有下降。
　　（2）藤黃酸聯合銅離子對體內蛋白酶體活性的影響
　　采用培養(yǎng)的人乳腺癌細胞 MCF-7為研究對象，種于60mm培養(yǎng)皿中，待MCF-7細胞80%-90%融合，加入不同濃度的藥物置于37度恒溫箱中反應6小時。將每孔蛋白收集起來，調至1

14、.0μg，然后將96孔板每孔分別加入10μg蛋白、180μL Tris-HCl（PH7.4）（含2μL LSUC-LLVY-AMC）。將96孔板置于37度恒溫水浴箱孵育120min后用熒光分光光度計測定熒光值。酶活性隨藥物濃度增加而逐漸下降，藥物聯合后酶活性下降程度相應增加。
　?。?）藤黃酸聯合銅離子對內源性蛋白酶體底物的影響
　　在96孔板上每孔種800個細胞，每孔加入100ul含藥培養(yǎng)基，并設立空白對照及溶劑對照組，置