藤黃酸藥物聯(lián)合的細(xì)胞毒性效應(yīng)及其機(jī)制.pdf

1、背景與目的：
　　藤黃酸（Gambogic acid，GA）是天然存在于藤黃科植物藤黃樹(shù)(Garcinia hanburyi Hook. f.)的干燥樹(shù)脂。臨床研究證明，它對(duì)乳腺癌、淋巴瘤、皮膚癌、胃癌均有一定療效，而對(duì)正常造血系統(tǒng)和白細(xì)胞無(wú)影響。藤黃酸可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制血管生成、抑制端粒酶活性、抑制核膜孔蛋白表達(dá)、誘導(dǎo)細(xì)胞周期在G2/M期停滯，激活T淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)，是一個(gè)多靶點(diǎn)抗腫瘤藥物。實(shí)驗(yàn)室的前期結(jié)果發(fā)現(xiàn)藤

2、黃酸能夠抑制腫瘤細(xì)胞的蛋白酶體活性，本實(shí)驗(yàn)在前期結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討藤黃酸聯(lián)合不同藥物對(duì)正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞效應(yīng)，為藤黃酸的臨床應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)。
　　方法與結(jié)果：
　　1、大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Rat mesenchymal stem cells，rMSCs)體外分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增和鑒定
　　SD乳鼠頸椎脫臼致死后，雙側(cè)股骨，暴露骨髓腔，用含血清的培養(yǎng)液反復(fù)沖洗骨髓腔，收集骨髓細(xì)胞懸液到離心管中，低速離心，棄去上

3、清，用含10％FBS的低糖DMEM培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液后接種于T25培養(yǎng)瓶中。10天左右待細(xì)胞生長(zhǎng)匯合，用胰酶消化后按1：3的比例進(jìn)行傳代。約3代后可得到比較純凈的間充質(zhì)干細(xì)胞。為了檢驗(yàn)間充質(zhì)干細(xì)胞的多向分化潛能，按照文獻(xiàn)所述[18]誘導(dǎo)成脂。選擇P4-P10代rMSCs,接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板,24小時(shí)后,在誘導(dǎo)組的完全培養(yǎng)液中加入下列誘導(dǎo)劑(1μM地塞米松、5μg/ml胰島素、0.5 mM IBMX、50μM吲哚美辛)誘導(dǎo)10天后，在

4、倒置顯微鏡下可見(jiàn)胞漿內(nèi)含有數(shù)量不等、大小不一、強(qiáng)折光性脂滴的脂肪細(xì)胞，有的脂滴融合成較大的脂泡。
　　2、藤黃酸聯(lián)合蛋白酶體抑制劑MG132對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rMSCs)的影響
　　選擇大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為研究對(duì)象，按一定數(shù)量接種于96孔板中，24小時(shí)后待細(xì)胞單層融合，棄掉上清，加入含不同濃度的藤黃酸（0.25μM、、0.5μM、1μM），MG132（0.25μM、0.5μM、1μM）新鮮培養(yǎng)基，作用48小時(shí)。加入M

5、TS(CellTiter96 AQ MTS Reagent Powder)試劑，每100μL體積內(nèi)加入20μL，37度恒溫培養(yǎng)箱中孵育1-3小時(shí)，用多功能酶標(biāo)儀檢查光密度值,并計(jì)算聯(lián)合指數(shù)(Combination index,CI)。發(fā)現(xiàn)1μM藤黃酸與1μM MG132作聯(lián)合可抑制rMSC50%細(xì)胞活性，并呈濃度依賴(lài)關(guān)系，二者聯(lián)合指數(shù)CI<1,說(shuō)明兩藥應(yīng)用有協(xié)同作用。
　　3、藤黃酸聯(lián)合蛋白酶體抑制劑MG262對(duì)人肝癌細(xì)胞的細(xì)胞（

6、HepG2）影響
　　選擇人肝癌細(xì)胞的細(xì)胞（HepG2）為研究對(duì)象，按一定數(shù)量接種于96孔板中，24小時(shí)后待細(xì)胞單層融合，棄掉上清，加入不同濃度的藤黃酸（0.25μM、、0.5μM），MG262（0.025μM、0.05μM、0.1μM、0.2μM），作用48小時(shí)。加入MTS試劑，每100μL體積內(nèi)加入20μL，37度恒溫培養(yǎng)箱中孵育1-3小時(shí)，用多功能酶標(biāo)儀檢查光密度值,并計(jì)算聯(lián)合指數(shù) CI。發(fā)現(xiàn)藤黃酸與 MG262聯(lián)合作用可抑

7、制HepG2細(xì)胞活性，并呈濃度依賴(lài)關(guān)系，二者聯(lián)合指數(shù)CI<1,說(shuō)明兩藥應(yīng)用有協(xié)同作用。
　　4、藤黃酸聯(lián)合蛋白酶體抑制劑MG132對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rMSCs)內(nèi)泛素化蛋白質(zhì)的影響
　　試驗(yàn)選擇大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rMSCs)，加入不同濃度的藤黃酸（0.25μM、0.5μM），并且與MG132（0.25μM、0.5μM）聯(lián)合。作用12小時(shí)收集細(xì)胞，裂解細(xì)胞，抽提總蛋白進(jìn)行Western blot蛋白測(cè)定。SDS-PA

8、GE電泳根據(jù)論文所述方法，采用ECL-Plus測(cè)定試劑及Kodak公司生產(chǎn)的X光曝光成像系統(tǒng)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行采集。結(jié)果Ub的聚集與不同濃度的藤黃酸作用呈濃度依賴(lài)關(guān)系，藥物聯(lián)合之后 Caspase9出現(xiàn)降解帶。表明藤黃酸誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與蛋白酶體的關(guān)系有關(guān)，且可以激活Caspase9蛋白分子。
　　5、藤黃酸聯(lián)合銅離子對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7細(xì)胞的作用
　　采用人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞為試驗(yàn)對(duì)象，設(shè)立藤黃酸單獨(dú)組（0.75μM、

9、1μM、1.5μM、2μM），Cu單獨(dú)組（10μM、20μM、30μM），Cu20μM+藤黃酸（0.75μM、1μM、1.5μM、2μM）聯(lián)合組，加藥48小時(shí)用Annexin V/FITC雙染試劑盒標(biāo)記，在37度培養(yǎng)箱中孵育15-30min，在熒光倒置顯微鏡下觀察不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞，隨著濃度增加細(xì)胞出現(xiàn)變圓，聯(lián)合組貼壁細(xì)胞大部分浮起，說(shuō)明藤黃酸與銅聯(lián)合能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡，呈濃度依賴(lài)關(guān)系。同樣的條件下，用MTS法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)

10、藤黃酸和Cu聯(lián)合能抑制細(xì)胞活力，呈濃度依賴(lài)關(guān)系，計(jì)算聯(lián)合指數(shù)均<1,具有協(xié)同效應(yīng)。
　　6、藤黃酸聯(lián)合銅離子對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721細(xì)胞作用
　　采用人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721為試驗(yàn)對(duì)象，設(shè)立藤黃酸單獨(dú)組（0.75μM、1μM、1.5μM、2μM），Cu單獨(dú)組（10μM、20μM、30μM），Cu20μM+藤黃酸（0.75μM、1μM、1.5μM、2μM）聯(lián)合組，加藥48小時(shí)用Annexin V/FITC雙染試劑盒

11、標(biāo)記，在37度培養(yǎng)箱中孵育15-30min，在熒光倒置顯微鏡下觀察不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞，藤黃酸與銅聯(lián)合能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡，呈濃度依賴(lài)關(guān)系。同樣的條件下，用MTS法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1.5μM藤黃酸和20μMCu聯(lián)合能抑制細(xì)胞50%活力，呈濃度依賴(lài)關(guān)系，計(jì)算聯(lián)合指數(shù)具有協(xié)同效應(yīng)。
　　7、藤黃酸聯(lián)合銅離子對(duì)體內(nèi)外蛋白酶體活性的影響
　?。?）藤黃酸聯(lián)合銅離子對(duì)體外蛋白酶體活性的影響
　　采用培養(yǎng)的人乳腺癌細(xì)胞MCF

12、-7為研究對(duì)象，種于60mm培養(yǎng)皿中，待將MCF-7細(xì)胞80%-90%融合時(shí)倒掉原培養(yǎng)基，裂解細(xì)胞抽提全蛋白，蛋白濃度測(cè)定同上，調(diào)至1.0μg將不同濃度的銅（10μM、20μM、30μM）和15μM的藤黃酸各5μL混于490μLPH值為7.4的HCl中置于37度恒溫箱中反應(yīng)6小時(shí)。在96孔板中加入10μL/10μg蛋白，每個(gè)樣本設(shè)2個(gè)復(fù)孔。然后每孔分別加入180μL Tris-HCl（PH7.4）（含2μL LSUC-LLVY-AMC）

13、和10μL已孵育好的藥物。將96孔板置于37度恒溫水浴箱孵育120min后用熒光分光光度計(jì)測(cè)定熒光值。低濃度藥物作用下，酶活性基本無(wú)變化，僅在Cu1.0uM與GA0.75uM時(shí)酶活性略有下降。
　?。?）藤黃酸聯(lián)合銅離子對(duì)體內(nèi)蛋白酶體活性的影響
　　采用培養(yǎng)的人乳腺癌細(xì)胞 MCF-7為研究對(duì)象，種于60mm培養(yǎng)皿中，待MCF-7細(xì)胞80%-90%融合，加入不同濃度的藥物置于37度恒溫箱中反應(yīng)6小時(shí)。將每孔蛋白收集起來(lái)，調(diào)至1

14、.0μg，然后將96孔板每孔分別加入10μg蛋白、180μL Tris-HCl（PH7.4）（含2μL LSUC-LLVY-AMC）。將96孔板置于37度恒溫水浴箱孵育120min后用熒光分光光度計(jì)測(cè)定熒光值。酶活性隨藥物濃度增加而逐漸下降，藥物聯(lián)合后酶活性下降程度相應(yīng)增加。
　　（3）藤黃酸聯(lián)合銅離子對(duì)內(nèi)源性蛋白酶體底物的影響
　　在96孔板上每孔種800個(gè)細(xì)胞，每孔加入100ul含藥培養(yǎng)基，并設(shè)立空白對(duì)照及溶劑對(duì)照組，置