納米銀肝細(xì)胞毒性效應(yīng)及凋亡機(jī)制研究.pdf

1、納米科技的不斷發(fā)展，納米材料廣泛地應(yīng)用于人們?nèi)粘Ｉ钪?，而納米銀作為一種新型抗菌材料，是目前商品化程度最高的納米材料之一，被廣泛地應(yīng)用于衛(wèi)生、保健、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。納米銀產(chǎn)品不斷地開發(fā)和應(yīng)用，生物體頻繁暴露于金屬銀的環(huán)境中，所受到的潛在生物安全性威脅也隨之增大，因此納米銀的生物安全性定量評(píng)估亟待解決。已有的研究顯示納米銀可以通過(guò)不同的途徑進(jìn)入生物體，進(jìn)而隨著血液循環(huán)到達(dá)新陳代謝活躍的器官，多數(shù)研究表明納米銀的蓄積和作用靶器官是肝臟。本課題組

2、先前的小鼠急性毒性試驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)力學(xué)研究也顯示，納米銀進(jìn)入體內(nèi)可廣泛分布于全身各組織器官，而肝臟和脾臟是納米銀蓄積和作用的靶器官。然而體內(nèi)研究并未對(duì)納米銀毒作用機(jī)制給出更多解釋。體外細(xì)胞研究表明，納米銀細(xì)胞毒性效應(yīng)主要表現(xiàn)為降低細(xì)胞活力，損傷細(xì)胞膜，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，影響炎癥因子分泌，改變細(xì)胞間隙連接通訊，損傷DNA，以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等。由于大多數(shù)研究所用的細(xì)胞類型不同，納米銀材料特性如粒徑大小、表面修飾等的差異，所以對(duì)于納米銀細(xì)胞毒性的產(chǎn)生

3、機(jī)制尚無(wú)比較明確一致的解釋。此外最近一些研究發(fā)現(xiàn)，納米銀對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)有較明顯的增殖抑制作用。因此本研究選擇靶器官肝臟來(lái)源的兩種細(xì)胞株作為研究對(duì)象，人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞和人正常肝細(xì)胞株L02細(xì)胞，通過(guò)一系列研究比較納米銀對(duì)兩種細(xì)胞的毒性效應(yīng)差異，進(jìn)一步探討其毒性作用機(jī)制，為納米銀的生物安全性評(píng)價(jià)以及在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　為了更好的研究市場(chǎng)化納米銀的毒理學(xué)效應(yīng)，反映人們實(shí)際接觸的納米銀材料可能具有的潛在威脅，本

4、研究使用商品化的納米銀材料，平均粒徑為(23.44±4.92 nm)，表面由聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)包被，比較納米銀對(duì)HepG2細(xì)胞和L02細(xì)胞毒性效應(yīng)的差異，包括細(xì)胞活力、細(xì)胞膜損傷、細(xì)胞形態(tài)的改變以及細(xì)胞內(nèi)納米銀的分布等，并尋找納米銀對(duì)兩株細(xì)胞毒性效應(yīng)差異的劑量范圍，在此劑量下研究探討納米銀誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。
　　1、納米銀材料表征以及細(xì)胞培養(yǎng)液中離子動(dòng)力學(xué)研究:①市售納米銀為PVP包被的納米銀材料，通過(guò)透射電鏡(T

5、EM)和掃描電鏡(SEM)觀察，納米銀顆粒形態(tài)為球形，平均粒徑為(23.44±4.92 nm)，在細(xì)胞培養(yǎng)液中分散均勻，無(wú)團(tuán)聚現(xiàn)象。②馬爾文粒徑分析儀測(cè)得納米銀在細(xì)胞培養(yǎng)液中的水合粒徑為43.76nm。③在16.0 mg/ml的納米銀-細(xì)胞培養(yǎng)液分散液中所釋放的銀離子濃度幾乎可以忽略，且0～48h內(nèi)釋放的銀離子水平相對(duì)穩(wěn)定，為后續(xù)細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。
　　2、納米銀對(duì)HepG2細(xì)胞和L02細(xì)胞活力影響研究:①比較了MTT和CCK

6、-8兩種方法對(duì)納米銀暴露細(xì)胞活力測(cè)定的影響，發(fā)現(xiàn)兩種方法對(duì)兩種肝細(xì)胞的細(xì)胞活力測(cè)定結(jié)果基本一致。在較低劑量(20、40、80、160μg/ml)下納米銀對(duì)兩株細(xì)胞的細(xì)胞活力影響差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且染毒24h后，20～80μg/ml納米銀可增強(qiáng)L02細(xì)胞活性，而對(duì)HepG2產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒性;而染毒48h后，納米銀對(duì)兩種細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖均有一定抑制作用，隨著納米銀染毒劑量增大，細(xì)胞活性逐漸降低，表現(xiàn)出明顯的時(shí)間-劑量效應(yīng)。②在CCK-8方

7、法中選擇兩組銀離子對(duì)照，分別為高速離心法獲得的不同濃度的銀離子溶液以及硝酸銀溶液。結(jié)果表明硝酸銀的細(xì)胞毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于納米銀，而納米銀所釋放的銀離子濃度與納米銀本身劑量有關(guān)，只有640μg/ml的納米銀溶液中所釋放的銀離子對(duì)兩株細(xì)胞產(chǎn)生了一定的毒性效應(yīng)。而PVP溶液組，對(duì)兩株細(xì)胞活力均無(wú)明顯影響。故推論納米銀對(duì)細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)主要是納米銀單體發(fā)揮作用。③LDH法測(cè)定細(xì)胞膜損傷，結(jié)果表明20～160μg/ml納米銀誘導(dǎo)對(duì)肝細(xì)胞的細(xì)胞膜損傷具有

8、時(shí)間-劑量效應(yīng)，且HepG2細(xì)胞釋放的LDH活力明顯高于L02細(xì)胞，與MTT及CCK-8測(cè)定結(jié)果相一致。表明納米銀暴露對(duì)兩株細(xì)胞具有不同的毒性效應(yīng)，在相同劑量下，HepG2細(xì)胞比L02細(xì)胞對(duì)納米銀更加敏感。
　　3、納米銀對(duì)HepG2細(xì)胞和L02細(xì)胞形態(tài)的影響及納米銀在細(xì)胞內(nèi)的分布研究:①倒置顯微鏡觀察不同劑量下(0、20、40、80、160μg/ml)納米銀暴露24h或48h后HepG2細(xì)胞和L02細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)。HepG2細(xì)胞

9、形態(tài)明顯改變，皺縮變圓，數(shù)目減少，而L02細(xì)胞形態(tài)基本保持正常，有少量細(xì)胞收縮，細(xì)胞間距離變大，不再聚集生長(zhǎng)。②TEM觀察高劑量(160μg/ml)納米銀染毒肝細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)納米銀引起兩株細(xì)胞膜破壞，胞內(nèi)空泡化增多，核內(nèi)染色質(zhì)凝聚邊集在核膜周圍，線粒體腫脹，嵴消失或斷裂，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張。③TEM高倍鏡下觀察納米銀在細(xì)胞內(nèi)的分布，發(fā)現(xiàn)染毒24h在細(xì)胞膜周圍分散著納米銀顆粒，而染毒48h后，可在細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)觀察到納米銀顆粒，細(xì)胞核內(nèi)無(wú)發(fā)現(xiàn)。HepG2

10、細(xì)胞的線粒體有黑色顆粒沉著，而L02細(xì)胞可在溶酶體和內(nèi)吞小泡中發(fā)現(xiàn)黑色顆粒。納米銀染毒后引起兩株細(xì)胞的形態(tài)改變不同，在細(xì)胞內(nèi)的分布也具有差異。
　　4、流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定納米銀誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞和L02細(xì)胞凋亡機(jī)制研究:①納米銀可誘導(dǎo)兩株細(xì)胞早期凋亡率升高及線粒體膜電位下降，都具有時(shí)間-齊劑量依賴效應(yīng)。比較HepG2細(xì)胞和L02細(xì)胞暴露相同時(shí)間，相同劑量的納米銀分散液，可發(fā)現(xiàn)20～160μg/ml納米銀暴露24h或48h，HepG2細(xì)

11、胞的早期凋亡率和線粒體膜電位下降率均明顯高于L02細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。并且L02細(xì)胞在納米銀暴露24h后，其早期凋亡率和線粒體膜電位下降率均低于10％，即納米銀對(duì)L02細(xì)胞毒性較小，再次驗(yàn)證細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)結(jié)果。②細(xì)胞ROS產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，納米銀誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞ROS的產(chǎn)生具有劑量和時(shí)間效應(yīng);而對(duì)L02細(xì)胞，無(wú)論是染毒24h還是48h，其ROS水平均沒有顯著升高。因此認(rèn)為納米銀誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡與氧化

12、應(yīng)激有關(guān)，并且納米銀所誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞毒性高于L02細(xì)胞可能也與此相關(guān)。以上研究表明，納米銀誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞毒性的可能機(jī)制是納米銀誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，引起ROS產(chǎn)生，促使線粒體膜電位下降，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞早期凋亡。而對(duì)于L02細(xì)胞可能需要更高的劑量方可誘導(dǎo)相似的凋亡作用。
　　5、納米銀誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制:Western Blotting測(cè)定HepG2細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明納米銀誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡機(jī)制

13、可能與線粒體途徑和腫瘤壞死受體途徑有關(guān)。其中Cyt C、Caspase3、Caspase8和Caspase9蛋白水平隨著劑量升高均明顯升高，抗凋亡蛋白分子Bcl-2與促凋亡蛋白分子Bax的比值以及NF-κB蛋白表達(dá)水平隨著劑量升高逐漸降低。
　　綜上所述，納米銀對(duì)HepG2細(xì)胞和L02細(xì)胞具有一定的細(xì)胞毒性，且納米銀誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性主要是由納米銀單體發(fā)揮作用。在實(shí)驗(yàn)研究劑量下(20～160μg/ml)兩株細(xì)胞表現(xiàn)出不同的細(xì)胞毒性效應(yīng)

14、，HepG2細(xì)胞比L02細(xì)胞對(duì)納米銀更加敏感。造成兩株細(xì)胞毒性差異的原因可能是納米銀誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生ROS，而L02細(xì)胞卻沒有激發(fā)產(chǎn)生ROS，兩株細(xì)胞早期凋亡率、線粒體膜電位下降率均顯示具有顯著差異性。通過(guò)對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的測(cè)定，表明納米銀誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡與線粒體依賴途徑和腫瘤壞死受體途徑有關(guān)。因此，納米銀對(duì)HepG2細(xì)胞毒性作用的機(jī)制可能是:納米銀引起HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS水平上升，線粒體膜電位降低，使得線