使用遺傳學(xué)可示蹤轉(zhuǎn)基因斑馬魚技術(shù)進(jìn)行甲硝唑誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞破壞和再生的初步研究.pdf

1、目的: 本課題通過在胰島素基因特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下在胰島β細(xì)胞表達(dá)硝基還原酶融合性綠色熒光蛋白（INS：GFP—NTR），利用細(xì)菌硝基還原酶Nitroreductase (NTR) enzyme將甲硝唑Metronidazole (Mtz)轉(zhuǎn)變成細(xì)胞毒素DNA交聯(lián)劑，從而特異性介導(dǎo)胰島β細(xì)胞破壞，并在此基礎(chǔ)上建立活體內(nèi)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)甲硝唑?qū)D(zhuǎn)基因斑馬魚胰島β細(xì)胞破壞的定量分析體系。 方法: 選用AB系INS：GFP—NT

2、R轉(zhuǎn)基因斑馬魚的F1或F2代的胚胎，在受精后24小時(shí)（24 hpf）、36小時(shí)（36 hpf）和48小時(shí)（48 hpf）分別在5 mM、7.5 mM、10 mM和15 mM濃度的甲硝唑溶液中孵育24、36和48小時(shí)，利用熒光顯微鏡觀察胰島β細(xì)胞熒光表達(dá)的情況，同時(shí)應(yīng)用全胚胎原位雜交方法進(jìn)一步在分子水平上證實(shí)并定量胰島β細(xì)胞破壞的程度。 結(jié)果: 與正常對(duì)照組相比，在5 mM、7.5 mM、10 mM和15 mM濃度的甲硝唑

3、中孵育的斑馬魚胰島β細(xì)胞熒光表達(dá)均有減弱甚至消失，其中在受精后36小時(shí)（36 hpf）加 10 mM濃度的甲硝唑并孵育36小時(shí), 導(dǎo)致熒光明顯消失，并且畸形率和死亡率較低，相對(duì)于其他組效果明顯；受精后24小時(shí)（24 hpf）、36小時(shí)（36 hpf）和48小時(shí)（48 hpf）分別在5 mM、7.5 mM、10 mM和15 mM濃度的甲硝唑中孵育24小時(shí)熒光減弱不明顯；孵育48小時(shí)雖然熒光基本消失但死亡率和畸形率較高；原位雜交結(jié)果基本上與

4、GFP熒光表達(dá)相符合。 結(jié)論: （1）硝基還原酶/甲硝唑(NTR/MET)系統(tǒng)可以特異性地破壞轉(zhuǎn)基因斑馬魚體內(nèi)的胰島β細(xì)胞; （2）與其它受精后時(shí)間和甲硝唑孵育時(shí)間相比，轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎在受精后36小時(shí)（36 hpf）10 mM濃度的甲硝唑中孵育36小時(shí)熒光減弱明顯甚至消失，并且畸形率和死亡率較低；（3）.受精后36小時(shí)（36 hpf）10 mM濃度的甲硝唑中孵育36小時(shí)這一條件,是創(chuàng)造胰島β細(xì)胞破壞的轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型的