神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育示蹤轉(zhuǎn)基因豬模型的建立.pdf

1、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及其相關(guān)疾病的治療研究需要一個(gè)合適的動(dòng)物模型。小鼠、大鼠以及非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物是目前常用的人神經(jīng)系統(tǒng)研究動(dòng)物模型，但嚙齒類(lèi)動(dòng)物的大腦無(wú)腦回，在基因表達(dá)和各項(xiàng)生理指標(biāo)方面，也與人類(lèi)差異較大。選擇與人類(lèi)神經(jīng)系統(tǒng)更接近的動(dòng)物模型將會(huì)有利于獲得反映人類(lèi)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和疾病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程的更真實(shí)數(shù)據(jù)。從進(jìn)化上看，非人靈長(zhǎng)類(lèi)用于神經(jīng)系統(tǒng)是最接近于人類(lèi)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，但其價(jià)格昂貴，且存在倫理方面的障礙。而豬腦的構(gòu)造和大小與人腦相似，有多腦回結(jié)構(gòu)，而

2、且豬在體型大小、生理?xiàng)l件、器官發(fā)育和疾病發(fā)展等方面與人類(lèi)相似，因此，豬被認(rèn)為是一種出色的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和神經(jīng)疾病模型。深入研究豬神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，是豬成為人類(lèi)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及相關(guān)疾病的動(dòng)物模型的必要前提。神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育主要是神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育和成熟，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記和追蹤是研究其發(fā)育有效的途徑。本實(shí)驗(yàn)擬利用神經(jīng)細(xì)胞特異啟動(dòng)子，在豬不同的神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)不同的熒光，用以追蹤不同神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育。為此，我們首先克隆了神經(jīng)元特異啟動(dòng)子(PDGF-βpro

3、moter)、星形膠質(zhì)細(xì)胞特異啟動(dòng)子(GFAPpromoter)、小膠質(zhì)細(xì)胞特異啟動(dòng)子(ibalpromoter)，分別在其下游加上EGFP、ECFP和Tdtomato熒光基因，并進(jìn)一步將這三個(gè)獨(dú)立的表達(dá)單元連接在一個(gè)帶有neomycin基因的同一個(gè)載體上，最終構(gòu)建出了PDGF-GFAP-ibal載體。將該載體線性化后轉(zhuǎn)染五指山豬胎兒成纖維細(xì)胞(PFF)，通過(guò)G418篩選，獲得14個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞系，以這些陽(yáng)性細(xì)胞系作為供體細(xì)胞進(jìn)行體細(xì)胞核移

4、植，獲得體外重構(gòu)胚。再將這些重構(gòu)胚移植到代孕母豬輸卵管內(nèi)，共移植7頭母豬，其中3頭妊娠足月，生下10頭克隆小豬。通過(guò)PCR鑒定，5頭為陽(yáng)性，5頭為陰性，5頭陽(yáng)性豬轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平也存在差異。到目前為止，5頭陽(yáng)性豬有2頭因故死亡，2頭存活，一頭心臟灌注后取大腦鑒定。鑒定結(jié)果顯示，大腦、脊髓和海馬均有綠色熒光的表達(dá)，未發(fā)現(xiàn)青色和紅色熒光表達(dá)，由此說(shuō)明，我們至少是獲得了可追蹤神經(jīng)元發(fā)育的模型豬。我們的工作為制作人類(lèi)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及相關(guān)疾病動(dòng)物模