hCTLA-4Ig轉(zhuǎn)基因巴馬香豬內(nèi)耳發(fā)育畸形及聽功能異常動物模型建立.pdf

1、CTLA-4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4)，中文名稱細胞毒T淋巴細胞相關(guān)抗原4，作為白細胞分化抗原的一種，又名CD152，是T細胞表面上的一種跨膜受體，與CD28共同競爭享有B7分子配體，當(dāng)CTLA-4與B7分子結(jié)合后，可以導(dǎo)致T細胞表達無反應(yīng)性，進而表達免疫反應(yīng)的負調(diào)節(jié)。CTLA-4Ig主要是由CTLA-4分子細胞外功能區(qū)域和人自身免疫球蛋白IgG1的恒定區(qū)進行

2、結(jié)合的一種融合蛋白，是一種經(jīng)典的、研究功能明確的免疫抑制分子，CTLA-4Ig可以導(dǎo)致T細胞正常免疫反應(yīng)受限，從而導(dǎo)致免疫功能降低。為了研究CTLA-4Ig在內(nèi)耳發(fā)育及表達情況，我們與第三軍醫(yī)大學(xué)合作，以體細胞核移植方法構(gòu)建人源性hCTLA-4Ig轉(zhuǎn)基因巴馬香豬，角蛋白(K14)作為啟動子，靶向表達，從而避免了因全身性表達CTLA-4Ig導(dǎo)致的動物在胚胎發(fā)育期死亡。本次研究通過對hCTLA-4Ig轉(zhuǎn)基因巴馬香豬種群中個體的轉(zhuǎn)基因鑒定、聽

3、力學(xué)功能表型的分析和多種內(nèi)耳形態(tài)學(xué)方法的研究，對hCTLA-4Ig轉(zhuǎn)基因巴馬香豬耳聾做了初步研究。本次研究包括如下三個部分。
　　第一部分 hCTLA-4Ig轉(zhuǎn)基因巴馬香豬耳聾動物模型基因型鑒定及蛋白分布表達
　　首先，為了明確本研究的科學(xué)性，我們應(yīng)首先確保我們通過體細胞移植獲得的封閉家系種群后代的基因型，確保其基因穩(wěn)定遺傳，可靠。此外還還需明確CLTA-4基因是否在正常巴馬香豬發(fā)育過程中表達，及CTLA-4Ig是否在內(nèi)耳表

4、達。我們采用了PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）方法進行陽性巴馬香豬的鑒定以及用于種群繁衍的篩選。其中，在PCR結(jié)果中，因巴馬香豬轉(zhuǎn)基因豬個體表達了326bp的目的條帶，而正常野生型巴馬香豬未見明顯目的條帶表達，說明轉(zhuǎn)基因克隆豬家系穩(wěn)定。
　　第二部分 hCTLA-4Ig轉(zhuǎn)基因巴馬香豬聽力學(xué)功能檢測
　　為了研究CTLA-4Ig在內(nèi)耳表達中的作用，我們首先通過對hCTLA-4Ig轉(zhuǎn)基

5、因巴馬香豬的聽力學(xué)功能情況進行研究，在本次研究中，我們對hCTLA-4Ig轉(zhuǎn)基因巴馬香豬封閉種群20只轉(zhuǎn)基因克隆豬進行了聽力學(xué)篩查，采用了聽覺腦干反應(yīng)(auditory brainstem response，ABR)閾值檢測，并在相同檢測條件下測試了20只正常野生型巴馬香豬ABR閾值，進行統(tǒng)計學(xué)配對分析，發(fā)現(xiàn)hCTLA-4Ig轉(zhuǎn)基因巴馬香豬組ABR閾值與野生型巴馬香豬組ABR閾值之間具有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。通過聽力學(xué)功能的

6、檢測，我們發(fā)現(xiàn)hCTLA-4Ig轉(zhuǎn)基因巴馬香豬出現(xiàn)了不同程度的感音神經(jīng)性耳聾，從而說明hCTLA-4Ig轉(zhuǎn)基因巴馬香豬家系出現(xiàn)了聽力損失。
　　第三部分 hCTLA-4Ig轉(zhuǎn)基因巴馬香豬內(nèi)耳形態(tài)學(xué)觀察
　　在明確了解hCTLA-4Ig轉(zhuǎn)基因巴馬香豬聽力學(xué)表型特征后，我們通過對內(nèi)耳進行形態(tài)學(xué)變化研究，進一步從形態(tài)學(xué)和病理學(xué)角度判斷hCTLA-4Ig轉(zhuǎn)基因巴馬香豬異常特征。首先我們通過取材后直接在顯微鏡下比較觀察，hCTLA-4

7、Ig轉(zhuǎn)基因巴馬香豬耳蝸大小體積、耳蝸回數(shù)、聽小骨等發(fā)育未見與野生型巴馬香豬無明顯差異。
　　耳蝸標(biāo)本經(jīng)過火棉膠包埋后，采用連續(xù)切片，經(jīng)過HE染色后觀察，發(fā)現(xiàn)hCTLA-4Ig轉(zhuǎn)基因巴馬香豬耳蝸形態(tài)存在異常，出現(xiàn)corti's器結(jié)構(gòu)異常，前庭膜塌陷，中階狹窄等。其中耳蝸標(biāo)本制備后進行掃描電鏡觀察，纖毛多數(shù)成病理改變，毛細胞脫落。
　　在免疫熒光結(jié)果中，我們可以發(fā)現(xiàn)，hCTLA-4Ig在轉(zhuǎn)基因豬的耳蝸內(nèi)有表達，多集中在血管紋、螺