皮膚靶向表達(dá)hCTLA-4Ig轉(zhuǎn)基因巴馬香豬種群建立及其異種移植研究.pdf

1、一、背景
　　 CTLA-4Ig(human cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen4-immunoglobulin)是CTLA-4分子的細(xì)胞外功能區(qū)與人免疫球蛋白IgG1恒定區(qū)相結(jié)合的融合蛋白。它是功能明確、經(jīng)典的免疫抑制分子，可與B7結(jié)合，阻斷CD28/B7正性共刺激信號通路，誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫無反應(yīng)。許多研究都證實(shí)了其可以延長移植物存活時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)室前期與西南醫(yī)院燒傷研究所吳軍教授課

2、題組合作，利用hCTLA-4Ig基因重組腺病毒體外感染非轉(zhuǎn)基因豬皮膚，成功研制了離體基因修飾活性皮膚，也有效延長了活性豬皮膚在人體創(chuàng)面的存活時(shí)間。
　　 然而，全身性表達(dá)CTLA-4Ig的轉(zhuǎn)基因動物難以成活。研究報(bào)道敲除CTLA-4基因的小鼠及全身高表達(dá)pCTLA-4Ig的轉(zhuǎn)基因豬都在出生后不久死亡，提示CTLA-4Ig對轉(zhuǎn)基因動物自身免疫功能有一定的影響，若調(diào)控性、限制性的表達(dá)CTLA-4Ig可能會降低該蛋白對轉(zhuǎn)基因動物全身免

3、疫功能的影響，提高制備轉(zhuǎn)基因動物的成功率。
　　 大面積燒傷病人由于自體及異體皮膚不足以滿足移植需要，豬皮膚作為臨時(shí)替代和覆蓋物已在臨床上應(yīng)用。皮膚是非血管化器官，其移植后的排斥反應(yīng)主要以細(xì)胞排斥為主。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期的實(shí)驗(yàn)，以hCTLA-4Ig腺病毒體外修飾的基因轉(zhuǎn)染豬皮能夠顯著延長其豬皮在燒傷病人創(chuàng)面存活時(shí)間，但體外病毒轉(zhuǎn)染方法為單次轉(zhuǎn)染單次應(yīng)用，涉及病毒制備及轉(zhuǎn)染工藝，成本高、工藝復(fù)雜、效率低、穩(wěn)定性差、質(zhì)量控制難度高。因

4、此，構(gòu)建皮膚靶向表達(dá)hCTLA-4Ig并可穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因豬群體或品系作為皮膚供體，可望形成穩(wěn)定、高效、經(jīng)濟(jì)的異種移植皮膚來源。
　　 巴馬香豬是我國小型豬群體中唯一具有白色被毛的品系，且體表白毛面積大、繁殖力強(qiáng)、抗病力強(qiáng)、性格溫馴，生物學(xué)特性明確，是適合的醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物。利用標(biāo)準(zhǔn)化的巴馬香豬構(gòu)建轉(zhuǎn)基因豬種群，可望提高轉(zhuǎn)基因豬品系或群體的標(biāo)準(zhǔn)化、提高供體豬皮膚一致性，從而提高模型研究科學(xué)性、產(chǎn)品穩(wěn)定性。
　　 研制皮膚靶向

5、表達(dá)hCTLA-4Ig轉(zhuǎn)基因巴馬香豬是本實(shí)驗(yàn)研究最終目的。但由于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因豬周期長、成本高、風(fēng)險(xiǎn)大，而小鼠繁殖力強(qiáng)、世代間隔短、研究時(shí)間短、經(jīng)濟(jì)成本低，因此在構(gòu)建轉(zhuǎn)基因豬以前構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠有利于提高研究的可控性。同時(shí)，構(gòu)建小鼠、豬的皮膚靶向表達(dá)hCTLA-4Ig轉(zhuǎn)基因動物模型，形成從小動物到大動物的模型體系，更有助于深入、系統(tǒng)研究hCTLA-4Ig及其在異種移植中的作用及機(jī)理。
　　 二、目的
　　 (一)建立小鼠、豬的

6、皮膚靶向表達(dá)hCTLA-4Ig轉(zhuǎn)基因動物模型，為系統(tǒng)研究hCTLA-4Ig分子對異種皮膚移植排斥反應(yīng)的調(diào)控功能，提供從小動物(小鼠)到大動物(豬)的模型體系。
　　 (二)建立皮膚靶向表達(dá)hCTLA-4Ig轉(zhuǎn)基因巴馬香豬群體，為研制高效、穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)的異種移植皮膚產(chǎn)品形成基礎(chǔ)。
　　 三、方法
　　 (一)皮膚靶向表達(dá)hCTLA-4Ig轉(zhuǎn)基因小鼠制備、種群建立及其功能驗(yàn)證
　　 通過慢病毒載體的方法構(gòu)建皮膚

7、靶向表達(dá)hCTLA-4Ig轉(zhuǎn)基因小鼠，并建立封閉繁育群體；用PCR方法進(jìn)行陽性小鼠的篩選和鑒定；用RT-PCR、real time PCR、ELISA、WB和免疫組化的方法研究轉(zhuǎn)基因蛋白在小鼠體內(nèi)的表達(dá)和分布；用單向MLC的方法，研究該轉(zhuǎn)基因蛋白在體外的生物活性：用小鼠→大鼠異種皮膚移植實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停^察移植皮膚的存活狀況、時(shí)間，研究該轉(zhuǎn)基因蛋白在體內(nèi)的生物學(xué)活性。
　　 (二)皮膚靶向表達(dá)hCTLA-4Ig轉(zhuǎn)基因巴馬香豬的構(gòu)建

8、r>　　 以體細(xì)胞核移植方法構(gòu)建皮膚靶向表達(dá)hCTLA-4Ig轉(zhuǎn)基因巴馬香豬；以PCR方法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因陽性豬篩選和鑒定；以WB方法初步分析轉(zhuǎn)基因豬體內(nèi)該蛋白的表達(dá)和分布。
　　 (三)皮膚靶向表達(dá)hCTLA-4Ig轉(zhuǎn)基因巴馬香豬種群建立及其異種移植研究
　　 通過體細(xì)胞核移植的方法構(gòu)建皮膚靶向表達(dá)hCTLA-4Ig轉(zhuǎn)基因巴馬香豬，并形成封閉繁育群體；用PCR方法進(jìn)行陽性轉(zhuǎn)基因豬的篩選和鑒定；以ELISA和WB的方法研究轉(zhuǎn)

9、基因蛋白在豬體內(nèi)的表達(dá)和分布；以單向MLC的方法，研究該轉(zhuǎn)基因蛋白在體外的生物活性；以豬→大鼠異種皮膚移植實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，觀察移植皮膚的存活狀況、時(shí)間，研究該轉(zhuǎn)基因蛋白在體內(nèi)的生物學(xué)活性；以病理切片HE染色來觀察皮膚移植后的組織學(xué)變化。
　　 四、結(jié)果
　　 (一)建立了皮膚靶向表達(dá)hCTLA-4Ig的轉(zhuǎn)基因小鼠種群，并證實(shí)了該轉(zhuǎn)基因蛋白在小鼠皮膚組織的特異性表達(dá)及其生物學(xué)活性。
　　 根據(jù)PCR結(jié)果證實(shí)本實(shí)驗(yàn)獲得8只

10、hCTLA-4Ig轉(zhuǎn)基因首建小鼠，轉(zhuǎn)基因首建鼠的得率(轉(zhuǎn)基因首建小鼠數(shù)/注射轉(zhuǎn)染的胚胎數(shù))是6.3%；并且通過這8只轉(zhuǎn)基因首建小鼠的橫交繁殖、PCR篩選，建立了皮膚靶向表達(dá)hCTLA-4Ig轉(zhuǎn)基因小鼠種群；RT-PCR和Western blot分析表明，hCTLA-4Ig蛋白實(shí)現(xiàn)了在轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚中的特異性表達(dá)，且表達(dá)水平較高；免疫組化分析也表明，hCTLA-4Ig在皮膚中的特異性表達(dá)，且該轉(zhuǎn)基因蛋白的表達(dá)對皮膚組織的正常發(fā)育和組織形態(tài)

11、沒有明顯影響；ELISA分析表明，hCTLA-4Ig蛋白因其呈可溶性表達(dá)，在轉(zhuǎn)基因小鼠血清中也有明顯的分布，其濃度達(dá)11.87μg/ml：在單向MLC實(shí)驗(yàn)中，小鼠血清中轉(zhuǎn)基因表達(dá)的hCTLA-4Ig蛋白明顯抑制了人淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)系統(tǒng)中反應(yīng)細(xì)胞的增殖，其程度與相同終濃度的純化重組蛋白hCTLA-4Ig相當(dāng)；在小鼠→大鼠皮膚移植實(shí)驗(yàn)中，hCTLA-4Ig轉(zhuǎn)基因小鼠的皮膚比相同品系野生型小鼠皮膚在受體的存活時(shí)間明顯延長。
　　 (二

12、)獲得了皮膚靶向表達(dá)hCTLA-4Ig的轉(zhuǎn)基因巴馬香豬種群，并證實(shí)了該轉(zhuǎn)基因蛋白在巴馬香豬皮膚組織的特異性表達(dá)及其生物學(xué)活性。
　　 成功獲得了皮膚靶向表達(dá)hCTLA-4Ig的轉(zhuǎn)基因克隆巴馬香豬，首建豬得率是0.75%；通過轉(zhuǎn)基因首建巴馬香豬與野生型巴馬香豬繁殖獲得的F1代進(jìn)行橫交繁殖，經(jīng)PCR篩選，建立了皮膚靶向表達(dá)hCTLA-4Ig的轉(zhuǎn)基因巴馬香豬種群；對F1代轉(zhuǎn)基因豬進(jìn)行PCR鑒定，在出生的59頭F1代豬中有32頭陽性(5

13、4.2%)；ELISA分析表明，hCTLA-4Ig蛋白因其呈可溶性表達(dá)，在轉(zhuǎn)基因巴馬豬血清中也有明顯的分布，隨機(jī)選取的5頭F1代轉(zhuǎn)基因巴馬香豬血清中hCTLA-4Ig蛋白的濃度在5.61～9.56μg/ml之間；Western blot分析表明，hCTLA-4Ig蛋白在轉(zhuǎn)基因豬的皮膚、角膜都有表達(dá)，但其表達(dá)水平稍低于內(nèi)參基因GAPDH，而野生型巴馬香豬的皮膚沒有明顯的表達(dá)條帶；在單向MLC實(shí)驗(yàn)中，豬血清中轉(zhuǎn)基因表達(dá)的hCTLA-4Ig蛋

14、白明顯的抑制了人淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)系統(tǒng)中反應(yīng)細(xì)胞的增殖，其程度與相同終濃度的純化重組蛋白hCTLA-4Ig相當(dāng)；在豬→大鼠皮膚移植實(shí)驗(yàn)中，hCTLA-4Ig轉(zhuǎn)基因巴馬香豬皮膚比野生型豬皮膚異種移植到大鼠背部后存活時(shí)間延長；組織石蠟切片HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，宿主對移植物的反應(yīng)程度具有差異，對轉(zhuǎn)基因豬皮膚的炎癥反應(yīng)明顯低于對野生型豬皮膚。
　　 五、結(jié)論
　　 (一)成功建立了皮膚靶向表達(dá)hCTLA-4Ig的轉(zhuǎn)基因小鼠和轉(zhuǎn)基因巴馬