豬暴發(fā)性肝衰竭動物模型的建立及研究應用.pdf

1、背景及目的:
　　 乙型肝炎病毒感染在發(fā)展中國家和亞太地區(qū)非常嚴重，我國是乙型肝炎病毒感染高發(fā)地區(qū)，人群攜帶率約10～15[％]。在我國，由乙型肝炎病毒引起的暴發(fā)性肝衰竭約占暴發(fā)性肝衰竭病因中的70～80[％]，嚴重威脅了人民的身體健康，亦給社會經(jīng)濟造成了沉重的負擔。暴發(fā)性肝衰竭是指患者在兩周內發(fā)生大量肝細胞壞死而出現(xiàn)以肝功能嚴重受損或/和以肝性腦病為主要特征的綜合征。該疾病發(fā)病兇險，進展迅速，目前臨床缺乏特異、有效的治療手段，

2、致病死率高達 80～90％。暴發(fā)性肝衰竭的發(fā)病機理尚不十分明確，其中有研究表明暴發(fā)性肝衰竭的發(fā)病與肝細胞凋亡有重要聯(lián)系。近年來本研究組在重型乙型肝炎患者和小鼠暴發(fā)性肝衰竭模型的實驗研究中，發(fā)現(xiàn)纖維介素(fgl2)與早期肝細胞壞死及疾病嚴重程度密切相關。Fgl2凝血酶原酶(簡稱fgl2)蛋白為纖維蛋白家族中的一員，由活化的淋巴細胞、巨噬細胞、血管內皮細胞表達，具有凝血酶原酶的活力，能夠催化凝血酶原轉化為凝血酶，啟動凝血過程，促進微血栓的形

3、成，加重肝細胞缺血缺氧，從而導致肝細胞大量壞死，出現(xiàn)暴發(fā)性肝衰竭。由于暴發(fā)性肝衰竭的發(fā)病機理復雜，加之現(xiàn)有技術手段難以實現(xiàn)乙型肝炎病毒的體外培養(yǎng)，因此建立一個穩(wěn)定可靠的動物模型對于暴發(fā)性肝衰竭的發(fā)病機制的研究和藥物評價尤為重要?，F(xiàn)有的暴發(fā)性肝衰竭模型主要局限于小動物模型，如寧琴等利用鼠肝炎病毒3型(Mouse hepatitis virus MHV-3)感染Balb/c小鼠建立的毒株依賴性暴發(fā)性肝衰竭模型；邱英鋒等聯(lián)合卡介苗(BCG)和

4、脂多糖(LPS) 誘導 Sprague Dawley(SD) 大鼠建立的急性免疫性肝損傷模型；以及賴力英等利用四氯化碳誘導大鼠建立的急性肝功能衰竭動物模型。小動物模型雖然具有來源簡單，易于推廣應用的優(yōu)點，但其體積大小及解剖學特點決定了其難以應用于暴發(fā)性肝衰竭治療藥物的臨床前安全性評價和療效評價，建立肝臟解剖和生理生化指標更接近人的大動物模型則可以實現(xiàn)基礎和臨床之間的過渡。
　　 本研究具體研究目標如下：
　　 1.建立一

5、個模擬人類疾病進程的豬暴發(fā)性肝衰竭模型，用于暴發(fā)性肝衰竭治療藥物的臨床前安全性評價及療效評價；
　　 2.檢測模型肝組織中fgl2凝血酶原酶(纖維介素)的表達情況，為針對fgl2的基因治療提供基礎和依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.使用D-氨基半乳糖鹽酸鹽誘導豬暴發(fā)性肝衰竭模型,分為造模組(耳靜脈快速注射D-氨基半乳糖鹽酸鹽，劑量為1.2g/kg)和陰性對照組(予以5％葡萄糖)給藥。觀察兩組動物臨床表現(xiàn)、肝臟功能生

6、化指標和組織病理學改變；
　　 2.Realtime PCR檢測肝組織中豬fgl2(pfgl2)mRNA水平的表達，免疫組化檢測肝組織中pfgl2蛋白的表達。
　　 結果:
　　 1.成功建立了與人在臨床表現(xiàn)、肝臟生化指標、組織病理學改變相似的豬暴發(fā)型肝衰竭模型：
　　 1.1生存時間：注射D-氨基半乳糖鹽酸鹽的造模組3頭豬全部于72h死亡；對照組3頭健康存活；
　　 1.2神經(jīng)系統(tǒng)變化：①疼痛刺

7、激反應：造模組實驗動物在48h開始出現(xiàn)疼痛刺激反應遲鈍，并逐漸加重；②肌強直：造模組實驗動物在48h開始出現(xiàn)站立不穩(wěn)，并在60h不能站立；③昏迷：造模組實驗動物在48h出現(xiàn)嗜睡，在60-72h出現(xiàn)淺昏迷；對照組實驗動物神經(jīng)系統(tǒng)無明顯變化。
　　 1.3肝臟功能生化檢測結果：造模組實驗動物的谷丙轉氨酶、一分鐘膽紅素、凝血酶原時間、血氨分別在24h開始上升，并在72h達到高峰；白蛋白、凝血酶原活動度分別在24h開始下降，并在72h達

8、到最低；對照組實驗動物的肝臟功能生化檢測未見明顯變化。
　　 1.4組織病理學變化：造模組尸檢可見肝臟體積增大、腫脹，表面有大量出血點。造模組肝臟組織石蠟切片，常規(guī) HE 染色觀察可見肝細胞大量壞死、肝索破壞明顯，有大量的出血和炎癥細胞浸潤。胃腸粘膜上皮細胞可見少量壞死脫落，余臟器未見明顯病變。對照組組織病理學檢查未見異常。
　　 2.fgl2在豬暴發(fā)型肝衰竭模型肝組織中的表達：
　　 2.1通過realtime

9、 PCR檢測pfgl2在肝臟的mRNA水平，結果顯示pfgl2在豬暴發(fā)性肝衰竭模型的肝組織中的pfgl2 mRNA表達水平較陰性對照組明顯增高；
　　 2.2用兔源性fgl2 多克隆抗體進行免疫組織化學染色，結果顯示豬暴發(fā)性肝衰竭模型的肝組織中有明顯的fgl2 蛋白的表達，表達細胞為肝細胞壞死區(qū)域的肝細胞、炎性浸潤細胞、肝血竇內皮細胞及血管內皮細胞,陽性棕染區(qū)域主要位于胞膜和胞漿；陰性對照組實驗動物肝組織未見fgl2陽性著色。<

10、br>　　 結論:
　　 1.以D-氨基半乳糖鹽酸鹽誘導的豬暴發(fā)性肝衰竭模型可以很好地模擬人類暴發(fā)性肝衰竭病理過程，為探討暴發(fā)性肝衰竭的發(fā)病機制和治療策略提供了有力的工具，是可用于評價暴發(fā)性肝衰竭治療藥物的臨床前療效及安全性的理想的大動物模型。
　　 2.Pfgl2在豬暴發(fā)性肝衰竭動物模型的肝組織中有mRNA水平和蛋白水平的異常高表達，提示pfgl2誘導的凝血途徑亦參與了暴發(fā)性肝衰竭肝細胞壞死的發(fā)生發(fā)展過程，針對fgl