實(shí)驗(yàn)用斑馬魚常見病原菌的分離檢測及其致病性研究.pdf

1、斑馬魚(Daniorerio，Zebrafish)，又稱藍(lán)條魚、花條魚等，原產(chǎn)于南亞，是一種常見的熱帶觀賞魚。近年來，隨著現(xiàn)代生命科技的不斷深入研究，斑馬魚作為一種新型的脊椎動物模式生物，被廣泛地應(yīng)用于發(fā)育遺傳學(xué)、環(huán)境毒理學(xué)及人類疾病模型與新藥篩選等生命科學(xué)相關(guān)領(lǐng)域，但其在細(xì)菌質(zhì)量控制方面與小鼠等法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)動物仍存在較大差距。在實(shí)驗(yàn)室人工飼養(yǎng)條件下，病原菌是干擾斑馬魚健康狀態(tài)的重要病原，為了有效的預(yù)防與控制細(xì)菌性病原對斑馬魚健康狀

2、態(tài)的干擾，以確保其用于科學(xué)實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量，如何建立快速準(zhǔn)確的病原菌檢測方法已成為了實(shí)驗(yàn)用斑馬魚研究與應(yīng)用的重要課題之一。
　　本研究以本實(shí)驗(yàn)室（上海實(shí)驗(yàn)動物研究中心斑馬魚實(shí)驗(yàn)室）自然發(fā)病且具有典型病癥的成年斑馬魚作為實(shí)驗(yàn)研究樣本，并以該實(shí)驗(yàn)室健康斑馬魚以及選自上海南方模式研究中心、上海萬商花鳥市場水族館的健康成魚作為實(shí)驗(yàn)對照，從病魚病灶組織及對照組相應(yīng)組織部位病原菌并進(jìn)行純培養(yǎng)后，共獲得8種優(yōu)勢菌株，并先后采用了形態(tài)觀察、生化鑒定及P

3、CR篩選的方法對所分離得到的8種細(xì)菌進(jìn)行了結(jié)果分析，得出結(jié)論1～8菌分別對應(yīng)為:假單胞菌屬、弧菌屬、溫和氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、類志賀鄰單胞菌、溫和氣單胞菌、泛菌屬及水生布戴約維采菌。進(jìn)一步針對該8種菌對健康斑馬魚進(jìn)行了致病性預(yù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)3、4及6號菌表現(xiàn)出了較強(qiáng)的致病性，其感染的斑馬魚出現(xiàn)了腹部紅腫、尾部潰爛等較為嚴(yán)重的病理癥狀，且高濃度受試組均在24h內(nèi)全部死亡，3種菌均隸屬于氣單胞菌屬，由此可見氣單胞菌是引發(fā)實(shí)驗(yàn)室斑馬魚患病的主要

4、病原菌。
　　為了針對氣單胞菌屬細(xì)菌感染斑馬魚的致病性展開進(jìn)一步研究，選取本實(shí)驗(yàn)室病魚體內(nèi)自行分離的4號嗜水氣單胞菌作為主要研究對象，并以購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)的編號為CGMCC1.2017的嗜水氣單胞菌作為陽性對照菌株，針對嗜水氣單胞菌的氣溶素基因AHA_0438、胞外絲氨酸蛋白酶基因ASP、嗜水氣單胞菌保守基因gyrB、16SrDNA及氣單胞菌屬設(shè)計(jì)特異性引物并進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，電泳條帶位置均與預(yù)期結(jié)

5、果相符。挑選保守基因gyrB及16SrDNA的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，經(jīng)由NCBI的BLAST軟件對樣本測序結(jié)果進(jìn)行同源性分析發(fā)現(xiàn)，與GenBank中登錄的其它嗜水氣單胞菌的同源性在94％以上，利用MEGA5.2軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)一步從分子水平上確認(rèn)了4號菌在氣單胞菌屬中的分型位置。此外，分別利用4號菌與陽性對照菌株對健康斑馬魚進(jìn)行人工感染實(shí)驗(yàn)，以確定該兩種菌株的致病性強(qiáng)弱，并通過制作感染發(fā)病斑馬魚的組織切片，分析了感染嗜水氣單胞菌