三重PCR檢測(cè)雞肉中常見(jiàn)病原菌的研究.pdf

1、食品安全問(wèn)題一直是一個(gè)世界范圍內(nèi)的公共衛(wèi)生安全問(wèn)題。近年來(lái)，食品安全事件頻發(fā)，食品安全問(wèn)題引起了國(guó)際社會(huì)的廣泛關(guān)注。致病菌污染是導(dǎo)致食源性疾病感染的主要因素，加強(qiáng)食品中致病菌的檢驗(yàn)力度是解決這一問(wèn)題的最有效的途徑。目前，國(guó)內(nèi)檢測(cè)食品中致病菌主要采用傳統(tǒng)的分離、培養(yǎng)、生化鑒定的方法，其操作繁瑣，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，通常需要一周才能完成，且靈敏度較低，已經(jīng)不能滿(mǎn)足食品中致病菌快速靈敏檢測(cè)的需要。PCR檢測(cè)方法具有高效、低成本、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，但是

2、普通PCR每次只能檢測(cè)一種或一類(lèi)致病菌，一旦檢測(cè)方向有誤就會(huì)造成時(shí)間和藥品浪費(fèi)。多重PCR與普通PCR原理相同，但能同時(shí)檢測(cè)多種食源性致病菌，彌補(bǔ)了普通PCR的缺點(diǎn)，節(jié)省了成本和時(shí)間，作為一種快速、高效且高通量的檢測(cè)方法在在致病菌檢測(cè)領(lǐng)域有著廣泛的發(fā)展空間。
　　 多重PCR是一種在同一反應(yīng)體系中加入針對(duì)多個(gè)靶基因分別設(shè)計(jì)的一對(duì)特異性引物，同時(shí)擴(kuò)增出多條目的基因片段的擴(kuò)增方法。本文以編碼小腸耶爾森氏菌黏附侵襲的ail基因、大腸桿

3、菌O157∶H7基因組中的ECs3032序列和沙門(mén)氏菌的invA基因，分別設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)對(duì)三種食源性致病菌的檢測(cè)。再利用正交試驗(yàn)方法設(shè)計(jì)L16(44)正交表，對(duì)影響多重PCR反應(yīng)的四個(gè)關(guān)鍵因素進(jìn)行初步優(yōu)化，再采用固定其他因素改變單一因素的方法進(jìn)一步進(jìn)行優(yōu)化，確定多重PCR反應(yīng)最終體系為25μL:10×PCRbuffer2.5μL，Mg2+(50mmol/L)、dNTPs(各2.5mmol/L)各2.0μL，模板各

4、1.5μL，上下游引物(10μmol/L)各1.5μL，0.4μ.LTaq酶(5U/μL)，加滅菌蒸餾水補(bǔ)足25μL;多重PCR擴(kuò)增程序?yàn)?多重PCR反應(yīng)采用冷啟動(dòng)，預(yù)變性94℃5min;變性94℃1min、退火54.1℃1min、延伸72℃2min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72℃延伸10min，反應(yīng)產(chǎn)物在2％的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。
　　 進(jìn)行引物特異性和反應(yīng)特異性試驗(yàn)，證明該方法具有較好的特異性。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行

5、測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果在GenBank上進(jìn)行在線BLAST比對(duì)，以驗(yàn)證方法特異性。證實(shí)了擴(kuò)增產(chǎn)物與目的基因同源性分別為99.15％、99.71％、97.61％。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，多重PCR同時(shí)檢測(cè)三種食源性致病菌純培養(yǎng)物的靈敏度均為103CFU/mL;采用試劑盒法提取DNA，人工污染雞肉樣品經(jīng)9h富集培養(yǎng)增菌后，三種致病菌在雞肉中的最低檢出限沙門(mén)氏菌和大腸桿菌O157∶H7為103CFU/mL，小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌可達(dá)到102CFU/mL，