斑馬魚補(bǔ)體調(diào)節(jié)因子CFI基因的鑒定、功能初探及CFH家族成員的急相反應(yīng).pdf

1、補(bǔ)體調(diào)節(jié)因子I(CFI)是哺乳動(dòng)物補(bǔ)體系統(tǒng)的重要組成成分，發(fā)揮著免疫調(diào)節(jié)的作用，在輔因子C4bp、MCP和CFH的作用下通過酶解C3b和C4b分子調(diào)節(jié)補(bǔ)體系統(tǒng)的過度激活。已有研究表明哺乳動(dòng)物中CFI有重要作用，且與疾病發(fā)生相關(guān)，但CFI在其它物種中研究較少。斑馬魚作為一種重要的模式動(dòng)物，其基因組測(cè)序已經(jīng)完成，與人類基因的保守性高達(dá)85％，這使得斑馬魚適于研究基因的表達(dá)與功能。本論文成功從斑馬魚中克隆了補(bǔ)體因子CFI，并分析了其特征、表達(dá)

2、，對(duì)功能進(jìn)行了初步探索，同時(shí)對(duì)CFI的輔因子CFH在胚胎發(fā)育中的表達(dá)模式及其對(duì)LPS和LTA感染的應(yīng)答進(jìn)行了分析。
　　 斑馬魚CFI mRNA全長(zhǎng)為2384bp，其中編碼區(qū)為2193bp，編碼含731個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，多肽鏈的分子量為81.4kDa，等電點(diǎn)pI為6.17。與其它脊椎動(dòng)物CFI蛋白的同源比對(duì)結(jié)果顯示序列相似性高達(dá)35.5％-67.1％，且序列中存在大量保守的半胱氨酸。CFI蛋白具有一段由18個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽和

3、5個(gè)保守域，即FIMAC、SRCR、LDLr1、LDLr2和SP結(jié)構(gòu)域。在信號(hào)肽與FIMAC結(jié)構(gòu)域之間還有一段特異性的序列，這段序列可能是魚類所特有的。成熟的CFI是由重鏈和輕鏈組成的異質(zhì)二聚體，F(xiàn)IMAC、SRCR、LDLr1和LDLr2組成重鏈，SP結(jié)構(gòu)域組成輕鏈，在輕鏈中存在保守的催化三聯(lián)體His-Asp-Ser和一個(gè)位于催化部位底部的Asp殘基。作為一種分泌型糖蛋白，斑馬魚的CFI序列中含有O-糖基化位點(diǎn)和N-糖基化位點(diǎn)，O-糖

4、基化位點(diǎn)主要位于信號(hào)肽和FIMAC結(jié)構(gòu)域之間的特異性序列區(qū)域，N-糖基化位點(diǎn)則分散存在于整個(gè)CFI序列之中。蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示斑馬魚CFI蛋白同人CFI蛋白的空間結(jié)構(gòu)具有很高的相似性，這預(yù)示它們功能上的相似性。進(jìn)化分析顯示，CFI蛋白在進(jìn)化上高度保守，哺乳動(dòng)物CFI基因聚為一枝，斑馬魚與硬骨魚的CFI蛋白聚為一枝。LDLr1結(jié)構(gòu)域和LDLr2結(jié)構(gòu)域的進(jìn)化樹中兩個(gè)結(jié)構(gòu)域各聚為一簇，在每一個(gè)結(jié)構(gòu)域的分枝中表現(xiàn)出與CFI蛋白全長(zhǎng)進(jìn)化樹相同的聚類

5、趨勢(shì)。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示斑馬魚CFI基因在各組織中廣泛表達(dá)，其中在卵巢、精巢、肝臟、腦、腸和眼中的表達(dá)量很高。當(dāng)受到LPS感染時(shí)，CFI在肝臟中的表達(dá)量上調(diào)。CFI基因和CFH家族基因在不同發(fā)育時(shí)期胚胎中具有不同的表達(dá)模式，CFI基因在胚胎發(fā)育的體節(jié)期表達(dá)量最多，而大部分CFH家族成員在1dpf胚胎中表達(dá)量開始顯著增多，其中CFHL4在胚胎發(fā)育整個(gè)過程中都具有很高的表達(dá)量。在體節(jié)期，當(dāng)胚胎受到LPS和LTA感染時(shí)，CFI基因的表

6、達(dá)量顯著下調(diào)，而CFH家族基因在胚胎發(fā)育不同時(shí)期則呈現(xiàn)不同的應(yīng)答趨勢(shì)，且表達(dá)量變化顯著。推測(cè)CFH家族基因在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中，通過多種形式對(duì)補(bǔ)體途徑進(jìn)行著精確的調(diào)控。胚胎整體原位雜交結(jié)果顯示，CFI基因在胚胎發(fā)育的過程中在卵黃合胞體上一直具有特異性表達(dá)，在體節(jié)期時(shí)信號(hào)最強(qiáng)。當(dāng)胚胎發(fā)育至1天時(shí)，CFI基因在松果體中也出現(xiàn)特異性表達(dá)。這提示CFI除了參與補(bǔ)體調(diào)節(jié)外，可能在早期發(fā)育過程中也起重要作用。初步實(shí)驗(yàn)表明過表達(dá)CFImRNA并沒有