基于VDR調控NF-κB信號通路探討銀屑Ⅰ號治療尋常型銀屑病的作用機制.pdf

1、目的:
　　1.觀察尋常型銀屑病患者皮損組織VDR、NF-κB、IκB蛋白表達差異，分析蛋白表達差異與疾病嚴重程度、中醫(yī)辨證分型的相關性，為中醫(yī)辨證分型及臨床用藥提供客觀參考依據(jù)。
　　2.觀察不同濃度銀屑Ⅰ號含藥血清對TNF-a誘導銀屑病細胞模型細胞因子(25HVD3、INF-γ、IL-1、IL-4、IL-17、IL-22)及VDR、NF-κB、IκB蛋白、基因表達水平的影響，以初步闡明銀屑Ⅰ號治療尋常型銀屑病的作用機制，

2、為銀屑Ⅰ號的臨床推廣提供理論依據(jù)。
　　3.腺病毒轉染法構建穩(wěn)定VDR-/-Hacat細胞株，觀察不同濃度銀屑Ⅰ號含藥血清對靶基因沉默的Hacat細胞模型細胞因子及VDR、NF-κB、IκB蛋白、基因表達水平的影響，以深入探討銀屑Ⅰ號抑制炎癥反應的作用靶點，為課題組后期深層次研究奠定基礎。
　　方法:
　　臨床研究部分
　　本課題參考尋常型銀屑病的中西醫(yī)診斷標準共納入病例102人，并進行中醫(yī)辨證，入組患者均來源于

3、廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院皮膚科門診及住院部，正常人皮膚組織由廣大整形美容醫(yī)院整形外科提供?；颊吆炇鹬橥鈺?，參考銀屑病皮損面積及嚴重程度評價標準行銀屑病面積及嚴重程度指數(shù)(Psoriasis Area and SeverityIndex，PASI)評分，分別對入組病例行組織病理染色及免疫組織化學檢測。采用Image-proplus6.0圖像分析軟件測定目標蛋白(VDR、NF-κB、IκB)積分光密度(integral optica

4、l density，IOD)。比較正常組、銀屑病組VDR、NF-κB、IκB蛋白表達差異，分析蛋白表達與PASI評分的相關性;比較血熱證、血虛證、血瘀證各組VDR、NF-κB、IκB蛋白表達差異。
　　實驗研究部分
　　1.銀屑Ⅰ號含藥血清對銀屑病細胞模型的影響分組:空白組(BG)、模型組(MG)、銀屑Ⅰ號低劑量組(LD)、銀屑Ⅰ號中劑量組(MD)、銀屑Ⅰ號高劑量組(HD)，其中空白組不予造模，按照常規(guī)操作細胞培養(yǎng)及藥物干預

5、，MG、LD、MD、HD各組均予TNF-a誘導造模，并予相應血清培養(yǎng)。分別采用酶聯(lián)免疫吸附法(ElISA)檢測各組細胞培養(yǎng)上清25HVD3、INF-γ、IL-1、IL-4、IL-17、IL-22濃度;實時熒光定量RT-PCR檢測各組VDRmRNA、NF-κBmRNA、Iκ BmRNA表達水平;蛋白印跡法(Western Blot)檢測Hacat細胞VDR、NF-κB、IκB蛋白表達水平。
　　2.VDR-/-細胞模型構建及驗證分組

6、:VDR-NC組、VDR-433組、VDR-544組、VDR-775組，慢病毒質粒均由蘇州吉瑪提供，遵照慢病毒轉染步驟轉染Hacat細胞，熒光顯微鏡觀察病毒轉染效率，RT-PCR、Western Blot法檢測各組細胞VDR基因、蛋白表達量，篩選出優(yōu)質、穩(wěn)定VDR-/-Hacat細胞株。
　　3.對照質粒及VDR775質粒對Hacat細胞的影響分組:空白組(BG)、模型組(MG)、對照質粒+模型組(NC-MG)、VDR775質粒+

7、模型組(si-MG)，ELISA法檢測各組培養(yǎng)細胞模型構建及驗證上清細胞因子濃度，RT-PCR、Western Blot法檢測各組VDR、NF-κB、IκB基因、蛋白表達量。
　　4.銀屑Ⅰ號含藥血清對VDR沉默前后Hacat細胞的影響分組:對照質粒+空白組(NC-BG)、對照質粒+模型組(NC-MG)、對照質粒+銀屑Ⅰ號低劑量組(NC-LD)、對照質粒+銀屑Ⅰ號中劑量組（NC-MD）、對照質粒+銀屑Ⅰ號高劑量組(NC-HD)、V

8、DR775質粒+空白組(si-BG)、VDR775質粒+模型組(si-MD）、VDR775質粒+銀屑Ⅰ號低劑量組(si-LD)、VDR775質粒+銀屑Ⅰ號中劑量組(si-MD）、VDR775質粒+銀屑Ⅰ號高劑量組(si-HD)，常規(guī)細胞培養(yǎng)24h，ELISA法檢測各組培養(yǎng)上清細胞因子濃度，RT-PCR、Western Blot法檢測各組VDR、NF-κB、IκB基因、蛋白表達量。
　　結果:
　　臨床研究部分
　　1.

9、銀屑病皮損組織VDR、IκB蛋白表達明顯低于正常組織（P＜0.01)，NF-κB蛋白表達明顯高于正常組織（P＜0.01）;且VDR蛋白表達量與PASI評分呈負相關(r=-0.474，P=0.000)，NF-κB、IκB表達量與PASI呈正相關(r=0.093，P=0.325;r=0.037，P=0.713)。
　　2.血熱組NF-κB表達量明顯高于血虛組、血瘀組;血瘀組VDR表達明顯高于血熱組、血虛組，NF-κB、IκB表達明顯低

10、于血熱組、血虛組;血虛組VDR表達量明顯低于血熱組、血瘀組。
　　實驗研究部分
　　1.銀屑Ⅰ號含藥血清對銀屑病細胞模型的影響
　　與BG組比較，MG組25HVD3水平顯著降低(P＜0.01)，INF-γ、IL-1、IL-4、IL-17、IL-22水平顯著升高（P＜0.01);VDR、IκB蛋白及基因表達水平明顯降低（P＜0.01)，NF-κB蛋白及基因表達水平明顯升高(P＜0.01)。與MG組比較，LD、MD、HD組

11、25HVD3水平顯著升高（P＜0.01），INF-γ、IL-1、IL-4、IL-22水平顯著降低（P＜0.01)，MD、HD組IL-17顯著降低（P＜0.01);LD、MD、HD組VDR、IκB蛋白表達均明顯升高（P＜0.05)，NF-κB蛋白表達明顯降低(P＜0.01); MD、HD組VDRmRNA表達水平均明顯升高（P＜0.05)，MD、HD組NF-κ B mRNA表達水平明顯降低(P＜0.05)，LD、MD、HD組Iκ BmRNA

12、表達水平均明顯升高(P＜0.05)。
　　2.VDR-/-細胞模型構建及驗證
　　采用VDR775質粒進行轉染時，VDR基因、蛋白表達水平均低于其他質粒;MOI=100時，VDR775質粒轉染效率最高，MOI=300時，VDR NC質粒轉染效率最高。
　　3.對照質粒及VDR775質粒對Hacat細胞的影響
　　與BG組比較，MG組25HVD3水平顯著降低（P＜0.01)，INF-γ、IL-1、IL-4、IL-1

13、7、IL-22水平顯著升高（P＜0.01);NF-κ B、IκB蛋白及基因表達水平明顯升高（P＜0.01)。與MG組比較，NC-MG組VDR、IκB、NF-κB蛋白及基因表達水平無明顯變化(P＞0.05)，細胞因子表達水平無顯著變化(P＞0.05);與NC-MG組比較，si-MG組25HVD3水平顯著降低（P＜0.01)，INF-γ、IL-1、IL-17、IL-22水平顯著升高（P＜0.01)，VDR、IκB蛋白表達明顯降低（P＜0.0

14、1)，VDRmRNA表達明顯降低（P＜0.01），NF-κB蛋白、基因表達明顯升高（P＜0.01)。
　　4.銀屑Ⅰ號含藥血清對VDR沉默前后Hacat細胞的影響
　　①銀屑Ⅰ號含藥血清對對照質粒干預Hacat的影響與NC-BG組比較，NC-MG組25HVD3水平顯著降低（P＜0.01)，INF-γ、IL-1、IL-4、IL-17、IL-22水平顯著升高（P＜0.01），VDR、IκB蛋白及基因表達水平均明顯降低(P＜0.0

15、1)，NF-κB蛋白、基因表達水平明顯升高（P＜0.01)。與NC-MG組比較，NC-LD組INF-γ、IL-1、IL-4顯著降低（P＜0.05)，NF-κB顯著降低(P＜0.01)，IκB明顯升高（P＜0.01);NC-MD組25HVD3明顯升高（P＜0.01)，INF-γ、IL-1、IL-4、IL-17水平顯著降低（P＜0.01)，VDR、IκB蛋白及基因表達顯著升高（P＜0.05)，NF-κB蛋白及基因表達顯著降低(P＜0.05)

16、; NC-HD組25HVD3明顯升高(P＜0.01)，INF-γ、IL-1、IL-4、IL-17水平顯著降低（P＜0.01)，VDR、IκB蛋白及基因表達顯著升高（P＜0.01)，NF-κB蛋白及基因表達顯著降低(P＜0.05)。
　?、阢y屑Ⅰ號含藥血清對VVDR沉默前后Hacat的影響與si-BG組比較，si-MG組25HVD3明顯降低（P＜0.01)，INF-γ、IL-1、IL-4、IL-17、IL-22明顯升高（P＜0.01

17、），VDR、IκB蛋白及基因表達顯著升高（P＜0.01)，NF-κB蛋白及基因表達顯著降低（P＜0.01）。與si-MG組比較，si-LD組25HVD3明顯升高（P＜0.01），INF-γ、IL-1、IL-4、IL-17明顯降低（P＜0.05)，VDR蛋白及基因顯著升高（P＜0.05)，NF-κB蛋白及基因表達顯著降低（P＜0.05);si-MD組25HVD3明顯升高（P＜0.01），INF-γ、IL-4、IL-17、IL-22顯著降低

18、（P＜0.05)，VDR、IκB蛋白表達顯著升高（P＜0.05)，NF-κB蛋白及基因表達顯著降低（P＜0.01)，Iκ BmRNA表達顯著升高（P＜0.01);si-HD組25HVD3明顯升高（P＜0.01)，INF-γ、IL-1、IL-4、IL-17、IL-22顯著降低（P＜0.05)，VDR蛋白及基因表達顯著升高（P＜0.01)，NF-κB蛋白及基因表達顯著降低（P＜0.01)，Iκ BmRNA顯著升高（P＜0.01）。
　

19、?、坫y屑Ⅰ號含藥血清對VDR沉默前后Hacat細胞的影響與對應NC組比較，si-BG組INF-γ、IL-1、IL-4、IL-17、IL-22顯著升高（P＜0.01），VDR蛋白、基因表達降低（P＜0.01）;si-MG組25HVD3明顯降低（P＜0.01)，INF-γ、IL-1、IL-17、IL-22顯著升高（P＜0.01)，VDR蛋白、基因表達降低（P＜0.05)，NF-κB蛋白及基因表達顯著升高（P＜0.05);si-LD組25HV

20、D3明顯降低（P＜0.01），INF-γ、IL-1、IL-4、IL-17、IL-22顯著升高（P＜0.05)，VDR蛋白、基因表達降低（P＜0.01)，NF-κB蛋白及基因表達顯著升高（P＜0.05)，IκB蛋白顯著升高（P＜0.01);si-MD組25HVD3明顯降低（P＜0.01)，INF-γ、IL-1、IL-17、IL-22顯著升高（P＜0.05)，VDR蛋白、基因表達降低（P＜0.05)，NF-κB蛋白及基因表達顯著升高（P＜0

21、.01）;si-HD組25HVD3明顯降低（P＜0.01)，INF-γ、IL-1、IL-4、IL-17、IL-22顯著升高（P＜0.05)，VDR蛋白、基因表達降低（P＜0.01)，NF-κB蛋白及基因表達顯著升高（P＜0.01);Iκ BmRNA蛋白顯著降低（P＜0.01）。
　　結論:
　　1.尋常型銀屑病皮損中VDR、IκB表達量低于正常人，NF-κB高于正常人，且蛋白表達與中醫(yī)辨證分型存在相關性，VDR信號抑制可能是

22、銀屑病發(fā)生、發(fā)展的重要原因，蛋白差異表達可為臨床辨證及用藥提供參考依據(jù)。
　　2.銀屑Ⅰ號可促進生化因子25HVD3表達，抑制炎癥因子INF-γ、IL-1、IL-4、IL-17、IL-22濃度水平，其作用機制可能與調控VDR信號、NF-κB信號表達水平有關。
　　3.VDR775質?？沙晒D染Hacat細胞，顯著抑制VDR蛋白、基因表達水平，VDR NC質粒對銀屑病細胞模型生化功能無顯著影響。
　　4.成功構建野生型V