來(lái)氟米特對(duì)腎小球硬化中TGF-β-Smad信號(hào)通路影響的研究.pdf

1、目的：腎小球硬化是多種腎臟病慢性進(jìn)展至終末期腎哀竭的共同途徑，因此，探討腎臟纖維化的有效防治有重要意義。轉(zhuǎn)化牛長(zhǎng)因子（TGF-β1）在腎小球硬化過(guò)程中起重要作用。來(lái)氟米特（LEF）是一種免疫抑制劑。本實(shí)驗(yàn)選用不同濃度來(lái)氟米特進(jìn)行干預(yù)研究，觀察來(lái)氟米特（LEF）對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）刺激大鼠腎小球系膜細(xì)胞表達(dá)Ⅳ型（ColⅣ膠原）及Smad2/3表達(dá)的影響。探討其對(duì)TGF-β1/Smad信號(hào)傳導(dǎo)通路的作用，為來(lái)氟米特的腎臟保護(hù)作

2、用提供理論依據(jù)。 方法：采用體外培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細(xì)胞的經(jīng)典方法進(jìn)行系膜細(xì)胞（GMC）的復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代和鑒定后3～10代用于實(shí)驗(yàn)。 實(shí)驗(yàn)分組： （1）對(duì)照組（Ctrl）， （2）刺激組（TGF-β1，5ng/ml）， （3）LEF-1組（5μg/ml）+TGF-β1（5ng/ml）， （4）LEF-2組（50μg/ml）+TGF-β1（5ng/ml）。 分別于不同作用時(shí)間點(diǎn)（15

3、min、30min、1h、2h、6h）:①用間接免疫熒光法檢測(cè)P-Smad2/3表達(dá)的情況；②用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）方法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液的ColⅣ膠原蛋白表達(dá)量的變化。③采用熒光半定量RT-PCR法檢測(cè)Smad2mRNA表達(dá)的變化； 結(jié)果： ①間接免疫熒光結(jié)果 P-Smad2/3在對(duì)照組只有微量的表達(dá)，在TGF-β1（5ng/ml）刺激后30min細(xì)胞熒光著色顯著增強(qiáng)且集中在胞核及周邊。激活至少持續(xù)

4、2h，2h蛋白表達(dá)回落，細(xì)胞熒光著色轉(zhuǎn)淡并散在細(xì)胞質(zhì)中。與TGF-β1刺激組相比加上LEF（5μg/ml）、（50μg/ml）組P-Smad2/3蛋白表達(dá)下降，細(xì)胞熒光強(qiáng)度隨時(shí)間延長(zhǎng)及濃度加大而減弱。 ②細(xì)胞上清液檢測(cè)結(jié)果 在對(duì)照組ColⅣ膠原僅有少量基礎(chǔ)性分泌。與對(duì)照組相比TGF-β1（5ng/ml）刺激在30min、1h時(shí)間點(diǎn)ColⅣ膠原分泌量顯著上升，其刺激作用呈時(shí)間依賴關(guān)系15min開(kāi)始上升30min達(dá)高峰后Co

5、lⅣ膠原分泌量較前下降。與TGF-β1（5ng/ml）刺激組相比加上LEF（5μg/ml）、（50μg/ml）的抑制組ColⅣ膠原蛋白表達(dá)量明顯下降在30min到1h有顯著差異。但兩抑制組在2h及6h時(shí)間點(diǎn)ColⅣ膠原蛋白表達(dá)量無(wú)顯著差異。無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨時(shí)間增加抑制率增加說(shuō)明其抑制作用也呈時(shí)間依賴性關(guān)系。 ③熒光定量PCR結(jié)果 TGF-β1（5ng/ml）刺激組與對(duì)照組比較：Smad2mRNA在大鼠系膜細(xì)胞表達(dá)水平T

6、GF-β1（5ng/ml）刺激組組顯著高于對(duì)照組、加LEF處理（5μg/ml）、（50μg/ml）組的Smad2mRNA表達(dá)水平顯著低于TGF-β1（5ng/ml）刺激組組（F=11．836）。 結(jié)論： 1．人重組TGF-β1（5ng/ml）能顯著上調(diào)體外培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞P-Smads蛋白的表達(dá)。 2． TGF-β1/Smad信號(hào)傳導(dǎo)途徑在大鼠腎小球系膜細(xì)胞的激活能夠引起ColⅣ膠原分泌增多，其作用呈一定