貝前列素鈉對血管緊張素Ⅱ誘導小鼠足細胞凋亡的保護作用及其機制的初步探討.pdf

1、足細胞，即腎小球臟層上皮細胞，附著在腎小球基底膜的表面，參與腎小球濾過屏障的構(gòu)成。足細胞的損傷和凋亡可直接導致腎小球濾過屏障功能受損，對多種腎臟損傷（包括糖尿病腎臟?。┚兄匾饬x。糖尿病腎臟病(diabetic kidney disease，DKD)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)的主要微血管并發(fā)癥之一。抑制足細胞凋亡對防治早期糖尿病腎臟病具有重要價值。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(Renin-angiotensi

2、n-aldosterone system，RAAS)對糖尿病腎臟病的進展有著重要意義。RAAS系統(tǒng)的過度激活對足細胞的凋亡也有重要意義。轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是一種經(jīng)典的多功能細胞因子，與細胞增殖、分化及凋亡等多種細胞活動密切相關(guān)，在腎小球纖維化的進程中發(fā)揮重要作用。Schiffer等發(fā)現(xiàn)TGF-β1能夠通過激活p38MAPK信號通路誘導足細胞凋亡，而且在TGF-β

3、1轉(zhuǎn)基因小鼠身上可觀察到，TGF-β1過表達可激活SMAD(sma-and MAD-related)蛋白家族最終導致小鼠腎小球硬化。絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen active protein kinase，MAPK)是一類絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，主要包括p38MAPK(p38 mitogen active protein kinase，p38MAPK)、c-Jun-N末端激酶(c-jun amino-terminal kinas

4、e，JNK)、細胞外信號調(diào)控的蛋白激酶(Extracellular signal-regulated kinase mediates，ERK)等主要亞型，是介導細胞外信號到細胞內(nèi)的重要信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)。p38MAPK信號通路的激活與DKD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，BPS可通過拮抗AngⅡ?qū)Τ銮蛐用}的收縮作用進而能夠有效減少糖尿病大鼠腎臟的尿白蛋白排泄，并且能夠降低p38MAPK信號通路活性，抑制TNF-α、TGF-β1、MMP-9等多

5、種炎癥因子的生成，對腎臟起到保護作用。Li等也認為BPS可能通過抑制p38MAPK信號活化來減少糖尿病心肌細胞凋亡，具有細胞保護作用。
　　因此，本研究以小鼠腎小球足細胞為研究對象，觀察BPS對AngⅡ誘導小鼠足細胞凋亡的影響，探討B(tài)PS對足細胞的保護作用及可能的機制。本文具體研究包括以下兩部分:
　　第一部分：貝前列素鈉對血管緊張素Ⅱ誘導的足細胞凋亡的影響
　　目的：
　　1.觀察培養(yǎng)的條件永生化小鼠足細胞在不

6、同環(huán)境下的形態(tài)學變化，掌握細胞培養(yǎng)的基本操作過程。
　　2.觀察不同濃度BPS對AngⅡ環(huán)境下小鼠腎小球足細胞MPC5細胞活性的影響。
　　3.觀察不同濃度BPS對AngⅡ環(huán)境下小鼠腎小球足細胞MPC5細胞凋亡的影響。
　　4.觀察不同濃度BPS對AngⅡ環(huán)境下小鼠腎小球足細胞MPC5細胞中caspase3蛋白活化表達的影響。
　　方法：
　　1.細胞培養(yǎng):實驗細胞為條件永生化小鼠腎小球足細胞系(condi

7、tionallyimmortalized mouse podocyte cell line，MPC5)，由南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院腎病中心實驗室轉(zhuǎn)贈。未分化的小鼠足細胞用含10 U/mL的重組小鼠γ-干擾素（γ-interferon，IFN-γ）的RPMI1640培養(yǎng)基在33℃、5％CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，每2-3天傳代一次;用不含IFN-γ的RPMI1640培養(yǎng)基在37℃、5％ CO2培養(yǎng)箱中誘導分化，分化10-14天后可用于實驗。

8、>　　2.細胞分組:分化成熟的足細胞采用無血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24h以使細胞生長同步化，平衡后細胞分組如下:正常對照組（Control組，純RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)），血管緊張素Ⅱ組（AngⅡ組，AngⅡ濃度為10-7mol/L），AngⅡ聯(lián)合不同濃度的BPS組:AngⅡ濃度為10-7mol/L，BPS濃度分別為1μmol/L(μM)，2μM，5μM。倒置顯微鏡下觀察不同處理組的MPC5細胞形態(tài)學變化。
　　3.不同

9、處理組（Control組、AngⅡ組及AngⅡ聯(lián)合不同濃度BPS組）MPC5細胞分別培養(yǎng)24h、48h后用CCK-8法測定細胞活性。
　　4.不同處理組的MPC5細胞培養(yǎng)24h，收集1×106個細胞，采用AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法染色，上流式細胞儀進行足細胞凋亡的檢測。
　　5.不同處理組MPC5細胞培養(yǎng)24h，免疫印跡法檢測caspase3活化蛋白的表達。
　　6.采用SPSS19.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)

10、計學分析，統(tǒng)計結(jié)果用均數(shù)±標準差（n=3，(x)±s）進行描述。采用析因方差分析方法進行主效應和交互效應的分析;計量資料進行正態(tài)性檢驗，各處理組均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-wayANOVA)，任意兩組間比較，當滿足方差齊性時采用LSD法(Least-significantdifference test)，否則，用Welch法校正，采用Dunnett's T3法進行組間多重比較。P≤0.05被認為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)

11、果：
　　不同處理組足細胞分別培養(yǎng)24h、48h后，各處理組足細胞O.D值均有顯著差異（24h: F=899.009，P＜0.001;48h: F=51.341，P＜0.001）。與Control組比較，24h及48h的AngⅡ組的足細胞O.D.值均顯著降低，差異均具有統(tǒng)計學意義(P均＜0.001)。不同濃度BPS組與AngⅡ組比較，24h及48h的足細胞O.D.值均顯著增加，差異均具有統(tǒng)計學意義（24h1μMBPS: P=0.0

12、13;其余P均＜0.001）。
　　結(jié)論：
　　1.BPS能夠有效增強AngⅡ環(huán)境下小鼠足細胞的活性，對足細胞可能有保護作用。
　　2.BPS能夠有效抑制AngⅡ誘導的小鼠足細胞凋亡，在一定濃度范圍內(nèi)，該效應隨著BPS濃度升高而增強。
　　3.BPS能夠有效抑制AngⅡ誘導的小鼠足細胞凋亡，可能與減少AngⅡ環(huán)境下caspase3蛋白的活化有關(guān)。
　　第二部分：貝前列素鈉經(jīng)p38MAPK信號通路抑制血管緊張

13、素Ⅱ誘導的小鼠足細胞凋亡
　　目的：
　　1.觀察不同濃度BPS及SB203580對AngⅡ環(huán)境下小鼠足細胞TGF-β1蛋白、p38MAPK蛋白磷酸化的表達的影響。
　　2.觀察p38MAPK抑制劑SB203580對AngⅡ誘導足細胞凋亡的影響，探討p38MAPK信號通路是否參與了BPS對AngⅡ誘導足細胞凋亡的調(diào)節(jié)。
　　方法：
　　1.細胞培養(yǎng)同第一章
　　2.細胞處理分組:
　　Contr

14、ol組:1640培養(yǎng)基正常培養(yǎng)
　　AngⅡ組:以終濃度為10-7mol/L的AngⅡ孵育足細胞
　　5μMBPS組:以終濃度為為10-7mol/L的AngⅡ及5μmol/L的BPS共同孵育
　　SB203580抑制(SB)組:以p38MAPK特異抑制劑SB203580預孵育1h，再以AngⅡ培養(yǎng)MPC5細胞為SB抑制劑組。
　　3.應用免疫印跡法分別檢測0min，15min，30min，60min不同時間點An

15、gⅡ培養(yǎng)條件下小鼠足細胞系MPC5細胞p38MAPK磷酸化蛋白的表達。
　　4.選取AngⅡ環(huán)境下足細胞p38MAPK磷酸化蛋白增強表達最顯著的時間點，應用免疫印跡法分別檢測該時間點AngⅡ聯(lián)合不同濃度BPS或SB203580對足細胞p38MAPK磷酸化蛋白的表達。
　　5.分別以CCK-8檢測24h、48h各不同處理組（包括Control組、AngⅡ組、5μMBPS組及SB組）足細胞活性。
　　6.用AnnexinⅤ

16、-FITC/PI雙染法染色，上流式細胞儀檢測24h不同處理組（包括Control組、AngⅡ組、5μMBPS組及SB組）MPC5細胞的凋亡。
　　7.應用免疫印跡法，檢測各處理組（包括Control組、AngⅡ組、5μMBPS組及SB組）24hMPC5細胞的caspase3蛋白活化的表達。
　　結(jié)果:
　　1.AngⅡ刺激0 min(AngⅡ0')細胞僅有少量磷酸化p38MAPK蛋白表達，AngⅡ刺激15 min(An

17、gⅡ15')后p38MAPK磷酸化蛋白表達顯著增強(P=0.002)，刺激30 min(AngⅡ30')后p38MAPK磷酸化蛋白的表達開始減弱，刺激60 min(AngⅡ60')磷酸化p38MAPK信號仍有少量表達。
　　2.選取AngⅡ刺激15min進一步實驗。SB203580能夠有效地阻止AngⅡ誘導足細胞p38 MAPK磷酸化蛋白的表達（P=0.001）。與AngⅡ相比，除1μM外，其他濃度BPS培養(yǎng)足細胞，隨著BPS藥物

18、濃度的增加，足細胞p38MAPK磷酸化蛋白表達逐漸減少，差異均有統(tǒng)計學意義（2μMBPS: P=0.045;5μMBPS:P=0.017）。經(jīng)SB203580抑制p38MAPK磷酸化后，SB組p38MAPK磷酸化表達較AngⅡ組顯著降低(P=0.001)，與對照組和5μMBPS組相比，均無顯著差異（對照組:P=0.499;5μMBPS: P=0.182）。
　　結(jié)論:
　　BPS能夠有效保護AngⅡ環(huán)境下的小鼠足細胞，抑制c