TNFα在暴發(fā)性肝衰竭致肝腎綜合征大鼠腎小球濾過率下降機制中的研究.pdf

1、目的:
　　肝腎綜合征(HRS)的主要發(fā)病機制是腎小球濾過率(GFR)明顯下降。已知腎小球系膜細胞(GMC)收縮引起的腎小球濾過面積減少和腎小球入球動脈平滑肌細胞(VSMC)收縮引起的腎小球血液灌注降低，均可使GFR下降。而GMC、VSMC收縮又與胞漿游離Ca2+濃度([Ca2+]i)升高密切相關(guān)。Ⅰ型1，4，5-三磷酸肌醇受體（IP3RI）是細胞內(nèi)重要的Ca2+釋放通道，因此是我們的研究指標。腫瘤壞死因子α(TNFα)是單核巨噬

2、細胞產(chǎn)生的具有多種生物學活性的細胞因子，是引起重癥肝病發(fā)生發(fā)展的主要因子。TNFα與TNFR結(jié)合后通過PKCα途徑使GMC、VSMC內(nèi)IP3RI過度表達。而ET-1通過磷脂酰肌醇4，5-二磷酸磷酸化，使GMC及VSMC中IP3產(chǎn)生增多，IP3與IP3RI結(jié)合后引起胞內(nèi)鈣釋放，胞漿[Ca2+]i升高。HRS時血中TNFα水平異常升高，TNFα是否參與了GMC、VSMC收縮，從而引起GFR下降尚不清楚。D-氨基半乳糖(D-GaIN)聯(lián)合脂多

3、糖(LPS)誘導(dǎo)暴發(fā)性肝衰竭(FHF)大鼠構(gòu)建HRS模型，采用微滲透泵植入方法，用FITC-Inulin作為標記物測定GFR，檢測腎組織中IR3RI蛋白及IP3RI mRNA表達。然后分別用抗TNFα單克隆抗體、2-氨基乙基二苯硼酸鹽(2-APB)阻斷TNFα、IR3RI，再測定此時血中TNFα水平及GFR，觀察TNFα在其中的作用，為研究HRS時GFR下降的發(fā)病機制提供理論依據(jù)。
　　材料與方法:
　　1、材料
　　

4、選擇SPF級別雄性SD大鼠，體重220±20g。實驗前分籠飼養(yǎng)，室溫23±3℃，每隔12h開燈照明，普通飼料，自由飲水，飼養(yǎng)一周后用于實驗。
　　2、方法
　　(1)構(gòu)建HRS模型:尾靜脈注射D-GaIN(400mg/kg)、LPS（32μg/kg）的生理鹽水溶液。分別在給藥后1h、3h、6h、9h、12h、16h、24h采集血液，然后離心(3500r，4℃，5min)，取500μl上清液用于肝腎功能生物化學指標檢測，其余血

5、清-80℃保存用于檢測細胞因子TNFα、內(nèi)皮素-1(ET-1)。剪取部分肝腎組織置于組織固定液中，用于病理學檢查，其余組織-80℃保存。
　　(2)分組:分組1:0h，G/L1h、3h、6h、9h、12h、16h、24h，G1h、3h、6h、9h、12h、16h、24h, L1h、3h、6h、9h、12h、16h、24h;分組2:NS組、G/L12h組、G12h組、L12h組;分組3:NS組、G/L12h（G/L組）、G12h（G

6、組）、L12h(L組)、anti-TNFα-G/L12h(T組)、2APB-G/L12h(A組)。
　　(3)測定血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、鉀離子(K+)、鈉離子(Na+)、氯離子(Cl-);應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實驗方法測定血清TNFα、ET-1水平。
　　(4)肝組織常規(guī)HE染色，光鏡下觀察肝細胞壞死情況;電鏡下觀察腎組織結(jié)構(gòu)是否發(fā)生改變。
　　(5)根據(jù)肝腎功能損害及肝細胞壞死情況

7、，確定阻斷時間點為建模后12h。
　　(6)將注有FITC-Inulin溶液的微滲透泵植入大鼠腹腔，第7天構(gòu)建NS組、G/L12h組、G12h組、L12h組模型（每組各設(shè)置5只大鼠），12h后采集血液，應(yīng)用熒光分光光度計測定血清FITC熒光量，根據(jù)公式GFR=R/[Iss]計算GFR，GFR1(ml·min-1)，GFR2(ml·min-1·kgBW-1)，GFR3（ml·min-1·gKW-1）。結(jié)合之前檢測結(jié)果，確定HRS建模

8、成功。
　　(7)應(yīng)用Western-blot、Real-time PCR方法檢測腎組織中IP3RI蛋白及IP3RImRNA表達情況。
　　(8)將注有FITC-Inulin溶液的微滲透泵植入大鼠腹腔，按照分組3在植泵后第7天建模，其中T組、A組分別在建模前30min尾靜脈注射抗TNFα單克隆抗體、2-APB，12h后采集血液、肝腎組織標本。
　　(9)應(yīng)用熒光分光光度計測定血清FITC熒光量，根據(jù)公式GFR=R/[I

9、ss]計算GFR, GFR1(ml· min-1), GFR2(ml·min-1·kgBW-1), GFR3(ml·min-1· gKW-1),觀察抗TNFα抗體、2-APB對GFR的影響。
　　(10)應(yīng)用Western-blot、Real-time PCR方法檢測分組3各實驗組大鼠腎組織IP3RI蛋白及IP3RI mRNA表達情況，研究抗TNFα抗體、2-APB對IP3RI表達的影響。
　　(11)測定分組3各實驗組大鼠

10、血清TNFα、ET-1水平，觀察抗TNFα抗體、2-APB的阻斷特異性。再測定ALT、BUN、Cr、K+、Na+、Cl-水平，肝組織進行病理學檢查，觀察抗TNFα抗體、2-APB對肝腎功能及肝細胞壞死的影響。
　　結(jié)果:
　　1、血清肝腎功能生物化學指標及細胞因子檢測結(jié)果
　　G/L組ALT、BUN、Cr、TNFα、ET-1均在給藥后12h明顯升高達到峰值，與對照組相比均有顯著性差異(P＜0.05)，并且在12h時間點

11、G/L組上述五項指標分別與G組、L組比較，均有顯著性差異(P＜0.05)，從客觀上除外D-GalN、LPS藥物本身對五項指標的影響。K+濃度分別在給藥后3h、12h各出現(xiàn)一次峰值，Cl-濃度在給藥后12h明顯降低，與對照組比較均有顯著性差異(P＜0.05);Na+濃度無明顯變化。
　　2、肝腎組織學病理檢查結(jié)果
　　肉眼觀察D-GalN/LPS聯(lián)合給藥后12h肝臟呈醬紫色，充血腫脹，彌漫出血點，切面有暗紅色淤血或黃色乳糜狀壞

12、死物質(zhì)溢出。光鏡下肝細胞大塊壞死，沒有肝細胞再生，纖維間隔塌陷，充填大量紅細胞。電鏡下觀察腎小球、近曲小管、遠曲小管結(jié)構(gòu)均正常。
　　3、NS組、G/L12h組、G12h組、L12h組GFR結(jié)果
　　G/L12h組GFR與NS組比較明顯降低，降至NS組的33.4％，有顯著性差異(P＜0.05)。G/L12h組GFR再分別與G12h組、L12h組相比，差異均有顯著性(P＜0.05)。
　　4、Western-blot半定

13、量分析IP3RI蛋白表達
　　對照組IP3RI蛋白表達水平較低;G/L組從3h開始IP3RI蛋白表達增加，以12h最為明顯，與對照組比較有顯著性差異(P＜0.05)。在12h時間點G/L組IP3RI蛋白表達水平分別與G組、L組比較，均有顯著性差異(P＜0.05)。
　　5、Real-time PCR分析IP3RI mRNA表達
　　D-GalN/LPS聯(lián)合給藥后IP3RI mRNA表達增加，以9h最明顯，與NS對照組相

14、比有顯著性差異(P＜0.05)。在9h時間點G/L組IP3RI mRNA表達水平分別與G組、L組比較，均有顯著性差異(P＜0.05)。
　　6、T組、A組GFR計算結(jié)果
　　T組、A組的GFR與G/L組比較明顯增加，有顯著性差異(P＜0.05);與NS對照組比較，T組、A組校正后的GFR(GFR2，GFR3)比校正前(GFR1)更接近正常水平。再將T組與A組進行組間比較，無顯著性差異(P＞0.05)。
　　7、West

15、ern-blot半定量分析抗TNFα抗體、2-APB對IP3RI蛋白表達的影響
　　D-GalN/LPS聯(lián)合給藥后12h及A組IP3RI蛋白呈高水平表達，兩者之間無顯著性差異(P＞0.05);而T組IP3RI蛋白表達明顯減少，與G/L組比較有顯著性差異(P＜0.05);A組、T組進行組間比較有顯著性差異(P＜0.05)。
　　8、Real-time PCR分析抗TNFα抗體、2-APB對IP3RI mRNA表達的影響

16、　　D-GalN/LPS聯(lián)合給藥后9h IP3RI mRNA表達明顯增加，T組IP3RI mRNA表達明顯下降，兩者比較有顯著性差異(P＜0.05);而A組IP3RI mRNA表達水平與G/L組相近，差異無顯著性(P＞0.05)。
　　9、抗TNFα抗體、2-APB對肝腎功能生物化學指標及細胞因子水平的影響
　　T組、A組的ALT、BUN、Cr水平與G/L組比較均明顯降低，有顯著性差異(P＜0.05);T組ALT降低84％，

17、A組ALT降低44％，兩者比較，差異有顯著性(P＜0.05)，而BUN、Cr降低程度兩者相比無顯著性差異(P＞0.05); G/L組出現(xiàn)明顯高鉀、低鈉、低氯血癥，而T組、A組K+、Na+、Cl-濃度均恢復(fù)正常，再將T組、A組進行組間比較，無顯著性差異(P＞0.05)。
　　10、抗TNFα抗體、2-APB對肝細胞壞死的影響
　　T組肝細胞呈點狀或小灶狀壞死，A組肝細胞呈明顯灶狀或小片狀壞死。
　　結(jié)論:
　　1、

18、D-GalN/LPS聯(lián)合打擊SD大鼠，在動物水平模擬了人HRS的部分病理生理過程，成功構(gòu)建HRS動物模型。
　　2、D-GalN/LPS聯(lián)合打擊后12h肝腎功能損害及肝細胞壞死最嚴重，GFR下降最明顯，因此是HRS成模時間點，也是我們選擇的阻斷時間點。
　　3、HRS時IP3RI蛋白表達明顯增加，其上調(diào)時相與血中TNFα、ET-1升高時相一致。
　　4、IP3RI蛋白表達在轉(zhuǎn)錄水平受IP3RI mRNA的調(diào)控。

19、　　5、抗TNFα抗體預(yù)先阻斷后，大鼠腎臟IP3RI蛋白及IP3RI mRNA表達明顯減少，GFR卻顯著增加，揭示了TNFα是通過上調(diào)IP3RI蛋白及IP3RI mRNA表達，導(dǎo)致GFR降低。
　　6、2-APB預(yù)先阻斷后，雖然大鼠腎臟IP3RI蛋白及IP3RI mRNA表達無明顯降低，但是GFR卻顯著增加，表明2-APB對GFR降低的改善，不是由于下調(diào)IP3RI蛋白及IP3RI mRNA的表達，而是由于2-APB有效地阻斷了IP