TNF-α抗體對大鼠肝肺綜合征治療作用的研究.pdf

1、肝肺綜合征（Hepatopulmonary Syndrome，HPS）是各種慢性肝病的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，是在慢性肝病和（或）門靜脈高壓基礎(chǔ)上出現(xiàn)的肺血管擴張和動脈血氧合功能異常。臨床上以肝功能不全、肺血管擴張、進(jìn)行性呼吸困難、低氧血癥為主要表現(xiàn)。其中肺血管擴張在HPS的發(fā)病過程中起重要作用，是導(dǎo)致低氧血癥最重要的原因。目前認(rèn)為這種血管擴張是由于肝功能損傷時血管擴張因子和收縮因子之間的失衡所致。}tPS的發(fā)生率占肝病患者的10-20％，目前

2、除肝移植外，沒有很好的內(nèi)科治療方法。尋找有效的治療方法至關(guān)重要。
　　 目前認(rèn)為HPS的發(fā)病可能與細(xì)菌異位和內(nèi)毒素血癥有關(guān)。肝硬化時門脈血液回流受阻，腸粘膜淤血水腫，腸蠕動減弱以及膽汁分泌減少，腸道微生態(tài)出現(xiàn)失衡，主要表現(xiàn)為小腸細(xì)菌增加及菌群比例失調(diào)，可造成小腸粘膜屏障功能障礙，通透性增大，腸道菌群易位和腸道內(nèi)毒素釋放入血。慢性肝病、肝硬化及膽汁淤積，枯否細(xì)胞吞噬功能抑制，致使對門脈血的細(xì)菌或內(nèi)毒素的清除作用下降。同時，門.體分

3、流的形成致使腸道易位細(xì)菌及內(nèi)毒素繞過肝臟直接入血，形成菌血癥和腸源性內(nèi)毒素血癥（intestinal endotoxemia，IETM）。腸源性內(nèi)毒素血癥與肝病中肝功能的受損程度密切相關(guān)，并且能夠刺激體內(nèi)單核巨噬細(xì)胞合成、釋放眾多內(nèi)源性生物活性因子，IETM可能是肝臟疾病導(dǎo)致擴血管物質(zhì)與縮血管物質(zhì)失衡，最終導(dǎo)致肺血管改變的關(guān)鍵所在。
　　 實驗證明肝硬化時腫瘤壞死因子-α（tumor necrosisfactor-α，TNF-α

4、）表達(dá)明顯增加。且與血漿內(nèi)毒素呈正相關(guān)。TNF-α是由活化的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種活性多肽，是內(nèi)毒素所致肝肺綜合征的主要介導(dǎo)因子。細(xì)菌易位及內(nèi)毒素血癥的形成，導(dǎo)致體內(nèi)TNF-α等細(xì)胞因子水平增加，Kuffer細(xì)胞吞噬功能減退，細(xì)菌及其內(nèi)毒素進(jìn)入肺循環(huán)，肺血管內(nèi)巨噬細(xì)胞清除血液中的腸道細(xì)菌及其內(nèi)毒素，細(xì)菌內(nèi)毒素及TNF-α可激活巨噬細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子-κB （nuclear factor-B，NF-κB）使其活化，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄并促進(jìn)多種細(xì)胞因子合

5、成。肺血管內(nèi)巨噬細(xì)胞廣泛集聚附著于肺小動脈、前毛細(xì)血管，毛細(xì)血管內(nèi)皮組織，進(jìn)入肺循環(huán)的細(xì)菌產(chǎn)物和致炎細(xì)胞因子例如TNF-α?xí)T導(dǎo)局部單核巨噬細(xì)胞趨化因子和巨噬細(xì)胞粘附分子，導(dǎo)致肺血管巨噬細(xì)胞的聚集和浸潤。肺內(nèi)巨噬細(xì)胞的浸潤使肺內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）和肺毛細(xì)血管內(nèi)巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，

6、iNOS）過度表達(dá)，體內(nèi)一氧化氮（nitric oxide，NO）生成增多。導(dǎo)致血管擴張，HPS的形成。因此認(rèn)為菌群易位及內(nèi)毒素血癥通過上調(diào)TNF-α而誘導(dǎo)肺血管內(nèi)巨噬細(xì)胞在肝肺綜合征的發(fā)病機理中發(fā)揮重要作用，導(dǎo)致肝肺綜合征發(fā)病率及嚴(yán)重程度增加。
　　 TNF-α抗體可通過抗原抗體結(jié)合反應(yīng)阻斷內(nèi)毒素所致的TNF-α的產(chǎn)生和作用，減少了TNF-α的病理性產(chǎn)生和釋放，阻斷TNF-α及NF-κB引發(fā)的細(xì)胞因子的級聯(lián)反應(yīng)，肝肺的病理發(fā)展

7、被部分阻斷或逆轉(zhuǎn)。
　　 近年來，用抗TNF-α治療Crohn’s病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強直性脊柱炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、糖尿病、多發(fā)硬化癥、腦卒中、惡性腫瘤、心肌炎和心力衰竭等疾病取得了良好效果，同時也為我們提供了新思路，試想TNF-α在HPS的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用，是否抗TNF-α治療為HPS開辟新的治療途徑?
　　 目的：通過膽總管結(jié)扎致HPS模型，并應(yīng)用TNF-α單克隆抗體進(jìn)行干預(yù)，了解治療前后肝、肺組織的病理改變，血

8、氣分析的變化，腫瘤壞死因子-α及內(nèi)毒素水平的變化，并觀察NF-κB蛋白的表達(dá)，從而探討TNF-α單克隆抗體對HPS的治療作用及機制。
　　 方法：成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠，體重250±25 g克，共60只，隨機分為三組，（1）假手術(shù)組（Sham組）6只。（2）膽總管結(jié)扎組（CBDL組）30只。（3）膽總管結(jié)扎組+TNF-α單克隆抗體組（CBDL+TNF-α單克隆抗體組）24只。膽總管結(jié)扎組+TNF-α單克隆抗

9、體組于CBDL造模后一周，經(jīng)腹腔注射TNF-α單克隆抗體（0.1g/kg/2d）；膽總管結(jié)扎組和假手術(shù)組動物腹腔注射相當(dāng)劑量的生理鹽水每2日1次。膽總管結(jié)扎組分別于結(jié)扎后1、2、3、4、5周麻醉動物取材。膽總管結(jié)扎組+TNF-α單克隆抗體組于干預(yù)治療1、2、3、4周麻醉動物取材。腹主動脈取動脈血立即送檢血氣分析，檢測PO2，公式計算P（A-a）O2；取靜脈血應(yīng)用全自動血清生化分析儀測定肝功能；應(yīng)用ELISA方法測定血清TNF-α的表達(dá)；

10、應(yīng)用大鼠鱟試劑盒檢測內(nèi)毒素水平；肝臟組織行HE及Masson染色觀察其病理變化；肺組織行臟染色觀察其病理變化；應(yīng)用western blot方法對肺組織NF-κB蛋白表達(dá)進(jìn)行定量分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.肝臟及肺臟病理改變：
　　 CBDL組肝臟病理臟及Masson染色顯示肝臟小膽管廣泛增生，膽管擴張，纖維組織增生，假小葉形成。CBDL+TNF-α單克隆抗體組大鼠肝臟}玎巳染色顯示小葉結(jié)構(gòu)變化不明顯，小膽管仍

11、有增生；Masson染色顯示門管區(qū)膠原纖維輕微增多，未見假小葉形成。假手術(shù)組HE染色肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝板排列整齊；Masson三色染色僅在門管區(qū)可見少量結(jié)締組織。
　　 CBDL組肺臟病理皿染色顯示大鼠肺臟肺泡隔增寬，肺間質(zhì)內(nèi)炎癥反應(yīng)明顯，可見巨噬細(xì)胞。肺間質(zhì)毛細(xì)血管密度有所增加，提示肺間質(zhì)血管擴張、充血，部分區(qū)域的肺泡腔略變小。CBDL+TNF-α單克隆抗體組肺臟毛細(xì)血管輕度擴張，肺泡間隔輕度增寬。假手術(shù)組肺泡呈半球形的小囊，

12、肺泡壁薄，相鄰肺泡之間可見由薄層結(jié)締組織構(gòu)成的肺泡隔，肺泡內(nèi)有連續(xù)的毛細(xì)血管和彌散存在的肺巨噬細(xì)胞。
　　 2.肝功能檢測：
　　 血漿ALT及TBIL在CBDL術(shù)后造模組1周明顯增加，與Sham組比較P<0.05，有明顯差異。之后雖逐漸下降，但均明顯高于Sham組。TNF-α單克隆抗體干預(yù)治療后1-2周即較同周CBDL組明顯下降，P<0.05，有明顯差異。之后，呈下降趨勢，但仍明顯高于Sham組。
　　 3.動

13、脈血氣分析檢測：
　　 CBDL術(shù)后2周肺泡.動脈氧分壓梯度差P（A-a）O2開始出現(xiàn)增大，與Sham組比較P<0.05，有明顯差異，之后呈上升趨勢。TNF-α單克隆抗體干預(yù)治療后1周與CBDL術(shù)后同周組比較有所下降，之后呈下降趨勢，至干預(yù)治療后3周與同周CBDL組比較P<0.05，有明顯差異，但仍明顯高于Sham組。
　　 4.內(nèi)毒素檢測：
　　 在動物CBDL造模術(shù)后1周起，血漿內(nèi)毒素水平顯著升高，與Sham

14、組比較P<0.05，有明顯差異，之后在此水平波動，3周時有所下降，但仍顯著高于Sham組。5周時又回升至術(shù)后1周水平。TNF-α單克隆抗體干預(yù)治療后1周血漿內(nèi)毒素水平開始明顯下降，且與同周CBDL組比較明顯降低，P<0.05。之后逐漸下降，但仍顯著高于Sham組。
　　 5.血漿TNF-α檢測：
　　 CBDL術(shù)后2周血漿TNF-α水平即明顯升高，與Sham組比較P<0.05，有明顯差異。之后呈上升趨勢，3周時血漿TNF

15、-α水平達(dá)高峰，4周時有所回落，5周又開始回升，但均明顯高于Sham組。TNF-α單克隆抗體干預(yù)治療后1周即開始明顯降低，且與同周CBDL組比較P<0.05。之后繼續(xù)下降，至干預(yù)治療后4周仍高于同周Sham組。
　　 6.肺組織NF-κB蛋白表達(dá)檢測：
　　 Western blotting顯示，在65KD的位置出現(xiàn)一條雜交帶，37KD的位置出現(xiàn)內(nèi)參照GAPDH的特異條帶。經(jīng)光密度測定分析結(jié)果：CBDL術(shù)后1周肺組織NF

16、-κB蛋白表達(dá)即開始明顯增加，與Sham組比較P<0.05，有明顯差異。至3周達(dá)高峰之后又下降，并在此范圍波動，但仍高于Sham組。TNF-α單克隆抗體干預(yù)治療后1周開始明顯下降，且與同周CBDL組比較P<0.05。之后在此水平波動，仍高于Sham組。
　　 結(jié)論：
　　 ① 進(jìn)一步證實了在肝肺綜合征的形成過程中，肝臟功能改變是肺功能變化的基礎(chǔ)。
　　 ② 在肝硬化形成過程中伴隨發(fā)生的IETM可能是肝功能障礙導(dǎo)致