TNF-α增強肝腎綜合征腎血管收縮機制的研究.pdf

1、目的:
　　肝腎綜合征(HRS)的病理生理標志是腎血管收縮，進而導致腎皮質血流量減少，腎小球濾過率(GFR)下降。GFR的大小決定于有效濾過壓和濾過系數，而腎血管收縮是引起有效濾過壓降低的決定因素。腎入球動脈平滑肌細胞(RASMCs)的功能狀態(tài)直接影響腎入球小動脈的舒縮，胞漿游離Ca2+濃度([Ca2+]i)升高與RASMCs收縮密切相關，由于RASMCs對許多縮血管活性物質（如兒茶酚胺、血管緊張素Ⅱ、血管加壓素、血栓素A2、內皮

2、素、白三烯等）均敏感，當接受這些物質刺激時，[Ca2+]i會明顯升高，引起細胞收縮。1，4，5-三磷酸肌醇受體(IP3R)是細胞內重要的Ca2+釋放通道，因此RASMCs中IP3R表達量的多少影響其對縮血管物質的敏感性。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)與重癥感染時腎衰的發(fā)生發(fā)展密切相關，HRS發(fā)生時血中TNF-α水平也明顯升高，有文獻指出TNF-α可間接參與平滑肌細胞的收縮。TNF-α可否影響IP3R表達進而參與RASMCs收縮引起的腎血

3、流減少尚不清楚。本研究應用離體灌注腎技術(IPKT)從器官水平觀察TNF-α預灌流后離體大鼠腎血管對ET收縮反應性的改變;應用原代培養(yǎng)的RASMCs，從細胞水平觀察TNF-α對[Ca2+]i及細胞收縮程度的影響;并從分子水平探討其可能機制，即TNF-α對RASMCs內Ⅰ型IP3R蛋白、mRNA表達及其啟動子活性的影響，揭示TNF-α在HRS發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　方法:
　　1、離體灌注腎實驗模型的建立
　　應用戊巴比

4、妥鈉(30 mg/Kg體重)經腹腔注射將大鼠麻醉。剪毛，腹壁消毒，正中切開，分離腸系膜上動脈、右腎動脈、右腎靜脈及右側輸尿管。用套管針從腸系膜上動脈插管，經腹主動脈，插入右腎動脈起始部，管外接三通，三通接張力換能器和灌注裝置，腎靜脈開放，在腸系膜上動脈及右腎動脈主干分別結扎。左腎取出稱重作為對照腎重。灌注過程:在腹主動脈插管至腎動脈時啟動灌注泵，開始灌流。灌注液流量恒定為5 ml/min，經熱交換器加溫至37℃，經氧合器持續(xù)給95％氧和

5、5％二氧化碳的混合氣，灌注液為一次性，不再循環(huán)應用。
　　2、觀察TNF-α對ET收縮腎血管強度的影響
　　28只SD大鼠隨機分為4組(n=7)，應用離體灌注腎技術(IPKT)灌流離體大鼠腎臟，并測定腎血管灌注壓。
　　分組:A1組無鈣Kreb's液預灌流+ET刺激;
　　A2組(TNF-α+無鈣Kreb's液)預灌流+ET刺激;
　　B1組(無鈣Kreb's液+2-APB)預灌流+ET刺激;
　　B

6、2組(TNF-α+無鈣Kreb's液+2-APB)預灌流+ET刺激。
　　3、原代大鼠RASMCs分離與培養(yǎng)
　　麻醉大鼠，開腹，于左腎動脈穿刺插管，用含6％BSA的冷PSS灌注至腎臟變白，留取皮質，經180μM的篩網擠壓過濾，將篩網上存留的血管組織經酶消化20min，經70μm的篩網過濾，再次經酶消化15min，原代分離大鼠RASMCs，于20％FCS的DMEM培養(yǎng)液、37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞生長至單層融合后常

7、規(guī)傳代。觀察細胞生長情況，經間接免疫熒光抗平滑肌α-肌動蛋白抗體、抗平滑肌肌球蛋白重鏈單克隆抗體染色陽性、透射電鏡觀察到微絲鑒定為RASMCs。取3-10代細胞用于實驗。
　　4、觀察TNF-α對胞內[Ca2+]i的影響
　　應用Fluo-3/AM熒光標記技術及confocol共聚焦顯微鏡檢測單個細胞內[Ca2+]i動態(tài)變化。分組:TNF-α處理0h+ET刺激組和TNF-α處理24h+ET刺激組;2-氨基乙基二苯硼酸鹽(2-

8、APB)+ ET刺激組和TNF-α+2-APB+ET刺激組。
　　5、觀察TNF-α對RASMCs收縮敏感性的影響
　　通過測量RASMCs收縮前、后的表面積得出細胞收縮的幅度。分組同測鈣組。
　　6、檢測TNF-α對RASMCsⅠ型IP3R蛋白及mRNA表達的影響
　　應用Western blot、Real-time quantitative PCR方法，檢測TNF-α處理后 RASMCs內Ⅰ型IP3R蛋白及m

9、RNA的表達。分組:TNF-α處理0h、4h、8h、24h組;
　　7、TNF-α對Ⅰ型IP3R啟動子活性的影響
　　將重組質粒PGL3-IP3RI promoter轉染RASMCs，通過檢測螢火蟲熒光素酶(luc)報告基因的表達活性，說明TNF-α對Ⅰ型IP3R啟動子活性的影響。分組:TNF-α處理0h、4h、8h、24h組。
　　結果:
　　1、大鼠離體腎體外灌注結果
　　平衡期過后，當分別將TNF-α

10、、2-APB加入灌注液中進行預灌流時，灌注壓仍保持在基礎灌注壓水平，無明顯改變。A1及A2組ET刺激后腎灌注壓較基礎灌注壓明顯升高(t=2.779，P=0.016;t=5.689，P=0.000)，且A2組灌注壓增高值與A1組相比具有顯著性差異(t=3.319，P=0.006);B1及B2組ET刺激后腎灌注壓無明顯改變。
　　2、RASMCs內[Ca2+]i測量結果
　　Fluo-3/AM標記后顯示，內皮素(ET)刺激可使R

11、ASMCs胞內[Ca2+]i在短時間內迅速、顯著的增加。TNF-α處理24h后上述效應明顯增強，[Ca2+]i上升幅度與0h組相比有顯著性差異(t=5.335，P=0.000)。且上述效應可被2-APB完全阻斷。
　　3、RASMCs表面積測量結果
　　TNF-α處理0h組加入ET約1min時，即出現可見的細胞收縮變化;3min時細胞形態(tài)變化最為明顯，細胞面積明顯縮小。TNF-α處理24h后上述效應明顯增強，細胞面積縮小的更

12、加明顯，與前者相比差異顯著(t=6.641，P=0.000)。
　　4、Western blot半定量分析RASMCsⅠ型IP3R蛋白的表達
　　0h組RASMCs內Ⅰ型IP3R表達水平較低，TNF-α處理4h～24h組Ⅰ型IP3R蛋白的表達明顯增高，以24h最為明顯，與0h組比較均有顯著差異(4h: P=0.039;8h: P=0.01;24h: P=0.003)。
　　5、實時定量PCR檢測RASMCsⅠ型IP3R

13、 mRNA表達
　　TNF-α處理4h～24h組RASMCs內Ⅰ型IP3R mRNA的表達明顯增高，以TNF-α處理8h時最為明顯，與0h組比較差異顯著(4h: P0.049;8h: P=0.002;24h:P=0.011)。
　　6、RASMCs內Ⅰ型IP3R啟動子活性檢測
　　在0h組RASMCs內，Ⅰ型IP3R啟動子活性很弱;TNF-α處理4h～24h組，Ⅰ型IP3R啟動子活性增強，以TNF-α處理8h最為明顯，