TNFα引起肝腎綜合征腎小球濾過率下降的機制研究.pdf

1、本研究采用腫瘤壞死因子α(TNFα)處理原代培養(yǎng)的GMCs，檢測其對胞漿Ca<'2+>濃度、細胞收縮程度、IP<,3>RI蛋白、IP<,3>RI mRNA表達水平及IP<,3>RI啟動子活性的影響，探討TNFα在其中的作用；同時探究TNFα對PKCα活性的影響，以及PKCα在TNFα-IP<,3>RI mRNA表達增加中的信號轉(zhuǎn)導作用，為HRS時GFR下降的發(fā)生機制提供理論依據(jù)。 研究材料與方法： 1、材料： 選

2、擇雄性Wistar大鼠，原代分離大鼠腎小球系膜細胞，并置于10％FCSDMEM培養(yǎng)液，37℃CO<,2>培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，原代培養(yǎng)2周后常規(guī)傳代，經(jīng)倒置顯微鏡形態(tài)學鑒定及免疫熒光抗α-肌動蛋白抗體染色陽性、抗角蛋白抗體染色陰性鑒定為系膜細胞，取3-8代細胞用于實驗。 2、方法： (1)分組：分組1：TNFα處理0h、2h、4h、8h、24h組；分組2：對照組(D組)、TNFα處理8h組(T組)、L-蘇式二氫神鞘氨醇(safi

3、ngol)處理8h組(S組)、TNFα與safingol共處理8h組(TS組)。每組設(shè)2個樣本，并用不同代細胞重復4次。 (2)應用Fluo-3/AM熒光標記技術(shù)及共聚焦顯微鏡檢測單個細胞內(nèi)Ca<'2+>濃度動態(tài)變化，觀察TNFα對胞內(nèi)Ca<'2+>濃度的影響。 (3)通過對收縮前、后的GMCs表面積進行測量得出細胞收縮的幅度，借以探討TNFα對GMCs收縮敏感性的影響。 (4)應用免疫細胞化學、Westem b

4、lot、Real-time PCR方法檢測TNFα對GMCs中Ⅰ型IP<,3>R蛋白及其mRNA表達的影響。 (5)將重組質(zhì)粒PGL<,3>-IP<,3>R<,1>promoter轉(zhuǎn)染GMCs，通過檢測螢火蟲熒光素酶(luc)報告基因的表達活性，說明TNFα對IP<,3>RI啟動子活性的影響。 (6)應用免疫熒光、體外磷酸化、Western blot方法研究TNFα對PKCα活性及PKCα蛋白表達的影響。 (7)

5、用Real-time PCR方法檢測抑制PKCα活性對TNFα上調(diào)IP<,3>RI mRNA表達的影響。 研究結(jié)果： 1、[Ca<'2+>]i測量結(jié)果Fluo-3/AM標記后顯示，內(nèi)皮素(ET)刺激可使GMCs胞內(nèi)鈣離子濃度在短時間內(nèi)有個迅速、顯著的增加。TNFα孵育4h、24h組上述效應明顯增強，兩組[Ca<'2+>]i上升幅度與對照組相比均有顯著性差異(p<0.05)，但TNFα處理4h與24h無顯著差異(p>0.0

6、5)。上述效應可被2-氨基乙基二苯硼酸鹽(2-APB)完全阻斷。 2、GMCs表面積測量結(jié)果對照組加入ET約lmin時，即出現(xiàn)可見的細胞收縮變化；4min時細胞形態(tài)變化最為明顯，細胞面積明顯縮小。TNFα孵育4h、24h組上述效應明顯增強，細胞面積縮小的更加明顯，以24h組為著，兩組與對照組相比差異顯著(p<0.01)。 3、免疫細胞化學檢測Ⅱ型IP<,3>R結(jié)果Ⅰ型IP<,3>R主要分布于GMCs的胞漿內(nèi)，以靠細胞核附

7、近的胞漿分布較為集中，在對照組表達水平較低。TNFα孵育4h-24h組均可發(fā)現(xiàn)棕褐色陽性信號增強，陽性細胞百分比增加，以24h時最為明顯，各組與對照組比較差異顯著(p<0.05)。 4、Western blot定量分析Ⅰ型IP<,3>R表達對照組Ⅰ型IP<,3>R表達水平較低；TNFα處理4h-24h組與對照組相比Ⅰ型IP<,3>R蛋白的表達明顯增高，以24h最為明顯，與對照組比較有顯著差異(P<0.05)。 5、實時定

8、量PCR檢測I型IP3RmRNA表達TNFα處理2h-24h組與對照組相比，Ⅰ型IP<,3>RmRNA的表達增高，以TNFα處理8h時最為明顯，差異顯著(P<0.05)。 6、IP<,3>RI啟動子活性檢測在對照組GMCs內(nèi)，Ⅰ型IP<,3>R啟動子活性很弱；TNFα處理4h-24h組，Ⅰ型IP<,3>R啟動子活性增強，以TNFa處理8h最為明顯，與對照組相比有顯著性差異(P<0.05)。 7、免疫熒光檢測PKCα的分布

9、對照組PKCα定位于胞漿內(nèi)，呈散在分布； TNFα處理8h-24h組，PKCα轉(zhuǎn)位于核周分布且部分轉(zhuǎn)位于核內(nèi)分布。 8、免疫沉淀后PKCα活性檢測對照組即存在相當活性的PKCa：TNFα處理8h-24h組PKCα活性明顯增強，以TNFα處理8h最為顯著(P<0.05)。 9、Westem blot定量分析PKCα蛋白表達GMCs中PKCα蛋白呈高水平表達，但PKCα蛋白的表達在TNFα處理各組與對照組間無顯著差異(p>0

10、.05)。 10、Real-time PCR方法分析PKCα抑制劑對TNFα上調(diào)Ⅰ型IP<,3>RmRNA表達的影響T組Ⅰ型IP<,3>RmRNA呈高水平表達；TS組與T組相比，Ⅰ型IP<,3>R mRNA的表達明顯下降，差異顯著(P<0.05)。 研究結(jié)論： 1、TNFα可增加ET刺激引起的胞內(nèi)鈣離子濃度。 2、TNFα增加ET刺激引起的胞內(nèi)鈣離子濃度是通過IP<,3>Rs來產(chǎn)生效應的。 3、T

11、NFα對ET引起的GMCs收縮起著協(xié)同作用。 4、TNFα處理的GMCs中，IP<,3>RI蛋白的表達及IP<,3>RImRNA的表達明顯增強，而且IP<,3>RI mRNA表達的上調(diào)在時相上先于IP<,3>RI蛋白的上調(diào)，說明TNFα可在IP<,3>RI mRNA的轉(zhuǎn)錄水平上進行調(diào)控。 5、TNFα處理的GMCs中，Ⅰ型IP<,3>R啟動子活性明顯增強，說明其可通過增強Ⅰ型IP<,3>R啟動子活性來誘導轉(zhuǎn)錄I型IP<,