暴發(fā)性肝衰竭大鼠腦中樞氨轉(zhuǎn)運體基因表達的改變.pdf

1、目的：
　　 暴發(fā)性肝衰竭（FHF）是一種以凝血酶原時間延長和肝性腦病為主要特征的臨床疾病，肝性腦病作為其好發(fā)且致死性強的一種并發(fā)癥，越來越得到人們的關(guān)注。目前研究表明，氨在致腦水腫致肝性腦病起了重要作用。因此研究氨進入腦中樞的機制以及在肝衰竭中其機制有否改變對將來可能阻滯氨的進入腦中樞有十分重要的意義。
　　 氨轉(zhuǎn)運體一類近來發(fā)現(xiàn)的一類專性轉(zhuǎn)運氨的蛋白，在原核細(xì)胞、真菌類和哺乳動物都有表達，為一類AMT/MEP/RH蛋

2、白。其在大鼠中表達為RhAG、RhD、RhBG和RhCG蛋白，在體內(nèi)各器官起轉(zhuǎn)運氨作用的為后兩種蛋白。目前研究表明氨轉(zhuǎn)運體蛋白在腎臟遠端腎小管上皮細(xì)胞、集合管上皮細(xì)胞、睪丸精索上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、十二指腸上皮細(xì)胞和腦中樞都有表達。然而其機制和分布并不十分明朗。本研究的目的為制作一個有效的暴發(fā)性肝衰竭的模型，并研究氨轉(zhuǎn)運體蛋白，包括RhBG蛋白和RhCG蛋白二者的基因在肝衰竭大鼠腦中樞基因表達的改變。
　　 材料與方法：
　　

3、 1、動物模型制備
　　 實驗動物為28只雄性Wistar大鼠，隨機分為4組。1組：800mg/Kg D-GaLN和10μg/Kg LPS聯(lián)用ip組，10只；2組：400mg/Kg D-GaLN和100μg/Kg LPS聯(lián)用ip組，5只；3組：800mg/Kg D-GaLN和100μg/Kg LPS聯(lián)用ip組，5只；4組：400mg/Kg D-GaLN和16μg/Kg LPS聯(lián)用iv組，8只。
　　 2、血清ALT水平

4、的測定
　　 應(yīng)用生物化學(xué)方法檢測血清ALT水平，以明確暴發(fā)性肝衰竭時肝臟功能生化學(xué)改變。
　　 3、大鼠生存曲線的建立
　　 記錄各組大鼠24小時死亡率和死亡時間，比較各組大鼠的生存曲線。
　　 4、建立時間點爆發(fā)性肝衰竭動物模型
　　 實驗動物為40只雄性Wistar大鼠，隨機分為6組，其中0h 5只，2h 5只，6h 5只，9h 5只，12h 10只，24h 10只。
　　 5、實時

5、定量PCR檢測
　　 應(yīng)用Trizol試劑提取腦組織RNA，利用實時定量PCR對RhBG、RhCG mRNA的表達作相對定量分析。采用SYBR Green Ⅰ熒光染料嵌合法，以構(gòu)建的RNA為標(biāo)準(zhǔn)品，分別對目的基因（RhBG、RhCG基因）和管家基因（GAPDH）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對樣品中的目的基因和管家基因分別進行定量。通過管家基因的校正，檢測各種樣品RhBG、RhCG基因mRNA的相對表達量。
　　 6、數(shù)據(jù)處

6、理
　　 結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并采用方差分析的方法，以P<0.05為差異具有顯著性。
　　 實驗結(jié)果：
　　 1、各組血清ALT水平及一般狀況的的比較
　　 LPS/GalN聯(lián)合注射后動物除800mg/Kg D-GaLN和10μg/Kg LPS聯(lián)用ip組各組大鼠都出現(xiàn)懶動，進食能力下降，各組動物終末時期ALT進行比較。2、3和4組ALT水平較1組明顯升高有顯著性差異（P<0.01），2、3和4組之間

7、無明顯差異。2、3和4組大鼠肝臟出現(xiàn)出血性大塊或亞大塊肝壞死，病理改變類似暴發(fā)性肝衰竭，而1組大鼠其肝臟只有部分點狀出血。
　　 2、大鼠生存曲線的建立
　　 2、3和4組大鼠出現(xiàn)了死亡，2組為20％，3組為40％，而4組達到了75％，1組大鼠無死亡。各組大鼠死亡時間集中在9到13小時之間。
　　 3、肝組織HE染色
　　 各組HE染色良好。1組肝組織結(jié)構(gòu)完整，肝板排列整齊，可見輕微點灶狀壞死及肝細(xì)胞腫脹

8、。2組肝組織肝板排列輕度紊亂，多處點灶狀壞死，肝細(xì)胞腫脹，少許嗜酸性變。3、4組FHF組肝板排列明顯紊亂，肝血竇明顯擴張淤血，多處點灶狀壞死，周圍肝組織可見大量紅細(xì)胞浸染。
　　 4、腦組織RhBG、RhCG mRNA的表達
　　 各時間點大鼠模型建立后，檢測目的基因的表達，發(fā)現(xiàn)RhBG、RhCG基因呈上升趨勢，12小時為頂點，12小時點后呈下降趨勢。其中9h、12h、24h各時間點與正常值差異有顯著性（p<0.05）。

9、
　　 結(jié)論：
　　 1、800mg/Kg D-GaLN和10μg/Kg LPS聯(lián)用ip組未造成明顯暴發(fā)肝損傷模型，和800mg/Kg D-GaLN和10μg/Kg LPS聯(lián)用ip組相比，其余三組ALT值差異較大，提示肝臟損傷嚴(yán)重，且出現(xiàn)大鼠死亡現(xiàn)象，400mg/Kg D-GaLN和16μg/Kg LPS聯(lián)用iv組大鼠死亡率高，大鼠肝衰竭現(xiàn)象明顯，是暴發(fā)性肝衰竭模型給藥的首選。
　　 2、在大鼠暴發(fā)性肝衰竭模型中