構(gòu)建三維培養(yǎng)體系誘導臍血干細胞向血小板分化的實驗研究.pdf

1、目的:
　　通過構(gòu)建殼聚糖-明膠三維支架，并用三維支架與旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)(RCCS)形成的三維培養(yǎng)體系(3D)來培養(yǎng)臍血分離的CD34+細胞，觀察臍血干細胞向血小板分化的情況。
　　方法:
　　1、冷凍干燥法制備不同濃度配比的殼聚糖-明膠支架，掃描電鏡觀察支架表面特征，測量支架的孔徑大小、并計算孔隙率、吸水率以及相容性測定，選取適合臍血干細胞生長的支架。
　　2、用磁珠分選的方法對人臍血CD34+細胞進行分離鑒定，將

2、臍血CD34+細胞附著在殼聚糖-明膠支架上，放入RCCS系統(tǒng)進行3D培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)，掃描電鏡觀察細胞在支架上的粘附生長狀況，MTT法檢測細胞活性，流式細胞儀檢測細胞標志物，以及對分化所得的血小板進行形態(tài)及功能鑒定，并與二維培養(yǎng)體系(2D)進行比較。
　　結(jié)果:
　　1、成功構(gòu)建殼聚糖-明膠支架，選用殼聚糖、明膠各0.5g，預凍溫度為-30℃條件下制備支架，孔徑為(86±21)μm、吸水率為(87.62±10.1

3、9)％、孔隙率為(92.56±1.12)％，細胞相容性好，無毒副作用，適宜臍血干細胞培養(yǎng)用三維支架。
　　2、磁珠分選出臍血CD34+細胞，將細胞以5×104/ml的種植率種植在2D和3D體系中。掃描電鏡觀察細胞粘附于支架上，生長狀況良好;3D培養(yǎng)第8dCD34+細胞可增殖(87.02±4.35)倍，2D培養(yǎng)到第5d達到峰值，細胞可增殖(20.78±5.03)倍，兩者間具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);流式檢測細胞膜表面標志物CD4

4、1+CD61+，培養(yǎng)到第7d、14d，3D體系測得的的結(jié)果為(28.70±1.75)、(82.40±2.91)）％，2D體系中測得的結(jié)果為(27.18±2.63)、(80.33±3.56)）％;3D培養(yǎng)系統(tǒng)所得類血小板顆粒較2D多，3D培養(yǎng)系統(tǒng)所得類血小板顆粒細胞數(shù)為(31.60±0.74)×106/ml，2D培養(yǎng)條件所得類血小板顆粒細胞數(shù)為(7.91±0.93)×106/ml，其黏附率為(43.05±1.93)％，2D為(41.37±