Cathepsin B與p-Akt在大鼠腦缺血再灌注損傷中的關(guān)系.pdf

1、背景與目的:
　　缺血再灌注損傷是腦缺血后半暗帶區(qū)的病理生理過程，拯救半暗帶區(qū)神經(jīng)細(xì)的凋亡是防治腦梗死進(jìn)展的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)溶酶體激活釋放組織蛋白酶B（Cathepsin B，CB）及磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol3-kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，Akt）通路激活共同參與了半暗帶區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，關(guān)于兩者之間是否存在著某種聯(lián)系的研究較少。本研究通過觀察大鼠短暫

2、性局灶性大腦中動(dòng)脈缺血再灌注損傷后，缺血半暗帶區(qū)（大鼠缺血側(cè)視前區(qū)）溶酶體的激活情況及蛋白CB與p-Akt的動(dòng)態(tài)表達(dá)，探討CB與p-Akt之間的關(guān)系，為缺血性卒中的防治提供新的理論基礎(chǔ)和治療思路。
　　方法：
　　清潔級(jí)健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠80只，10-12周齡，體重280±20g，隨機(jī)分為假手術(shù)后24h組（Sham）；腦缺血再灌注組（IRI組）；PI3K-Akt抑制劑（LY294002）組（LY

3、組）；Cathepsin B抑制劑CA-074組（CBI組），IRI組、LY組及CBI組大鼠再隨機(jī)分為3h、6h、12h、24h四個(gè)亞組。采用改良long線栓法制作大鼠短暫性局灶性大腦中動(dòng)脈缺血再灌注損傷模型(middle cerebral artery occlusion，MCAO)，術(shù)前30min側(cè)腦室穿刺注入 LY294002(25μg,5μl DMSO)及 CA-074（20μg/1μl*5μl），Sham組及IRI組同時(shí)間點(diǎn)側(cè)

4、腦室注入等體積DMSO（10ml/L）。采用Longa’s5級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分法進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分；通過電鏡觀察缺血半暗帶神經(jīng)元溶酶體形態(tài)學(xué)變化；用western blotting法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)Cathepsin B、p-Akt及24h亞組Caspase3的蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.造模成功率為74.23％。同IRI組相比較，CA-074可減少神經(jīng)功能缺損評(píng)分，LY294002能加重腦缺血再灌注損傷癥狀，使神經(jīng)功能

5、缺損評(píng)分增加（P<0.05）。
　　2.電鏡下，缺血再灌注組與Sham組相比，IRI組大鼠缺血半暗帶腦組織各時(shí)間點(diǎn)均有溶酶體的激活，溶酶體體積增大，數(shù)目增多，向次級(jí)溶酶體轉(zhuǎn)變；在缺血再灌注損傷后期（12h、24h），細(xì)胞逐漸出現(xiàn)凋亡甚至壞死的形態(tài)學(xué)改變。
　　3.蛋白印跡法分別檢測(cè)各組24h時(shí)間點(diǎn)的caspase3的表達(dá)，假手術(shù)組幾乎不表達(dá)，CA-074組表達(dá)較少，IRI組表達(dá)居中，LY組表達(dá)最多，與其行為學(xué)癥狀輕重程度具有

6、一致性。
　　4.在缺血側(cè)視前區(qū)大腦皮質(zhì)，Sham組未見 Cathepsin B及 p-Akt明顯表達(dá)；IRI組再灌注后3h、6h、12h、24h，CB及p-Akt均有明顯表達(dá)，0-3h達(dá)頂峰，3-12h有下降趨勢(shì)，但仍高于假手術(shù)組，12-24h較前有上升趨勢(shì)（P<0.05）；LY組Cathepsin B相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)3h、6h的表達(dá)較IRI組少（P<0.05），12h、24h的表達(dá)較IRI組明顯增多（P<0.05），從0-24h總體

7、呈上升趨勢(shì)；CBI組p-Akt相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)3h、6h的表達(dá)較IRI組少（P<0.05），12h、24h的表達(dá)較IRI組明顯增多（P<0.05），從0-24h總體呈上升趨勢(shì)。
　　結(jié)論：
　　1.大鼠腦缺血再灌注損傷可使神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)溶酶體激活。
　　2.在腦缺血再灌注損傷早期（0-6h），大鼠腦缺血半暗帶Cathepsin B與p-Akt的表達(dá)可能有相關(guān)性。
　　3.在腦缺血再灌注損傷中，單獨(dú)通過CA-074抑制溶酶體