大鼠腦缺血再灌注損傷Cathepsin D介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與MLK3的關(guān)系.pdf

1、目的:
　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠大腦中動(dòng)脈腦缺血再灌注模型，并運(yùn)用Cathepsin D抑制劑pepstatin A對(duì)其進(jìn)行干預(yù)，檢測(cè)Cathepsin D和pMLK3的蛋白表達(dá)變化，探討Cathepsin D與MLK3在大鼠腦缺血再灌注損傷過(guò)程中神經(jīng)細(xì)胞凋亡的關(guān)系，為研究溶酶體參與腦缺血再灌注損傷神經(jīng)細(xì)胞凋亡提供新的探索，為缺血性腦血管病提供新的治療靶點(diǎn)。
　　方法:
　　67只清潔級(jí)健康雄性Sprague-Dawle

2、y大鼠，體重280±20g，隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組（sham，n=7），模型組（M，n=30），干預(yù)組（I，n=30）：于再灌注前及再灌注后每12h腹腔注射溶酶體CathepsinD抑制劑pepstatin A2ml/100g（而假手術(shù)組及模型組于相應(yīng)時(shí)間腹腔注射生理鹽水2ml/100g）。其中模型組和干預(yù)組又分為2小時(shí)組（M-2h，n=6；I-2h，n=6），6小時(shí)組（M-6h，n=6；I-6h，n=6），24小時(shí)組（M-24h，n=

3、6；I-24h，n=6），48小時(shí)組（M-48h，n=12；I-48h，n=12）。應(yīng)用改良的Long線栓法制作大鼠大腦中動(dòng)脈腦缺血再灌注模型，缺血2小時(shí)后恢復(fù)再灌注，使用Longa’s的5級(jí)評(píng)分法評(píng)價(jià)神經(jīng)功能；使用TTC染色法、TUNEL凋亡檢測(cè)法及免疫組織化學(xué)方法，分別檢測(cè)腦梗死體積、細(xì)胞凋亡數(shù)量、Cathepsin D與pMLK3的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　1.模型成功率76.14％；模型組48小時(shí)相對(duì)腦梗死體積為3

4、7.36±1.44%，干預(yù)組48小時(shí)相對(duì)腦梗死體積為27.49±2.30%。
　　2.假手術(shù)組腦組織未見梗死灶，模型組和干預(yù)組缺血側(cè)皮質(zhì)及皮質(zhì)下可見白色梗死灶，但干預(yù)組48小時(shí)相對(duì)梗死體積較模型組減少（p=0.000），且干預(yù)組神經(jīng)功能缺損評(píng)分較模型組也得到明顯改善（p<0.05）。
　　3.大鼠腦缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)，假手術(shù)組凋亡細(xì)胞很少，模型組2小時(shí)可以觀察到凋亡細(xì)胞，6小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)呈上升趨勢(shì)（p<0.001）；干預(yù)

5、組2小時(shí)凋亡細(xì)胞較模型組2小時(shí)無(wú)顯著改變（p=0.127），干預(yù)組6小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)觀察到的凋亡細(xì)胞較模型組明顯減少（p<0.05）。
　　4.大鼠腦缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)，假手術(shù)組可見少量Cathepsin D的表達(dá)，模型組Cathepsin D的表達(dá)在再灌注2小時(shí)、6小時(shí)、24小時(shí)呈上升趨勢(shì)，24小時(shí)達(dá)高峰，48h組較24h組有所下降，但仍居高水平，均比假手術(shù)組高（p=0.000）；干預(yù)組各時(shí)間點(diǎn)Cathepsin D的表達(dá)較模

6、型組明顯減少（p=0.000）。
　　5.大鼠腦缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)，假手術(shù)組pMLK3少量表達(dá)，模型組pMLK3的表達(dá)在再灌注2小時(shí)即有大量表達(dá)，于6小時(shí)達(dá)高峰，之后逐漸下降，均高于假手術(shù)組（p=0.000）；干預(yù)組各時(shí)間點(diǎn)pMLK3的表達(dá)均較模型組明顯減少（p<0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.大鼠腦缺血再灌注損傷過(guò)程中溶酶體Cathepsin D可能通過(guò)上調(diào)MLK3的磷酸化而介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。
　　2.Pepsta