大鼠腦缺血再灌注損傷后Cathepsin L與p-Akt表達(dá)的研究.pdf

1、目的：
　　在腦缺血再灌注后半暗帶區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡中溶酶體組織蛋白酶L（Cathepsin L）與磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）通路均發(fā)揮了重要作用，但關(guān)于兩者在缺血性腦卒中半暗帶區(qū)之間的聯(lián)系研究甚少。通過建立大鼠大腦中動脈腦缺血再灌注損傷模型，運(yùn)用Western blotting檢測大鼠腦缺血半暗帶各相應(yīng)時間點(diǎn)Cath

2、epsin L及p-Akt蛋白表達(dá)的動態(tài)變化，同時使用Cathepsin L的特異性抑制劑Z-FY-DMK及PI3K/Akt的特異性抑制劑LY294002分別進(jìn)行干預(yù)，觀察蛋白的表達(dá)變化，探討Cathepsin L與p-Akt之間的關(guān)系。
　　方法：
　　選取周齡為10-12周的清潔級健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠85只，體重為280±20g，依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）10只；腦缺

3、血再灌注組（IRI組）25只；Cathepsin L抑制劑 Z-FY-DMK干預(yù)組（CLI組）25只；PI3K-Akt抑制劑LY294002干預(yù)組（LY組）25只，IRI組、CLI組及 LY組大鼠分別按3h、6h、12h及24h四個時間點(diǎn)每個時間點(diǎn)每組5只隨機(jī)分為四個亞組。采用改良longa線栓法制作大鼠大腦中動脈缺血再灌注損傷模型(middle cerebral artery occlusion，MCAO)，CLI組、LY組分別于術(shù)前

4、30min側(cè)腦室穿刺注入 Z-FY-DMK（20ug/1ul*5ul）及LY294002(25μg,5μl DMSO)，Sham組及IRI組于術(shù)前30分鐘側(cè)腦室注入濃度為10ml/L的DMSO5ul。對大鼠運(yùn)用Longa’s5級標(biāo)準(zhǔn)評分法評分；TTC染色檢測各組大鼠24h時間點(diǎn)相對腦梗死體積；Western blotting法檢測半暗帶區(qū)相應(yīng)時間點(diǎn)Cathepsin L、p-Akt及24h組Caspase3的蛋白表達(dá)變化。
　　結(jié)

5、果：
　　1.造模成功率是83.33％。Sham組大鼠未見神經(jīng)功能缺損癥狀；IRI組、CLI組、LY組大鼠均可見神經(jīng)功能缺損癥狀；與IRI組相比，CLI組大鼠腦神經(jīng)功能缺損評分較低，LY組大鼠腦神經(jīng)功能缺損評分較高（P<0.05）。
　　2.TTC染色檢測 Sham組大鼠腦組織未見白色梗死灶，IRI組、CLI組、LY組缺血側(cè)皮質(zhì)均可見蒼白色梗死灶，CLI組大鼠腦梗死體積較IRI組減小，LY組大鼠腦梗死體積較IRI組增加（P﹤

6、0.05）。
　　3.Western blotting檢測到Sham組大鼠缺血側(cè)大腦視前區(qū)皮質(zhì)可見Cathepsin L蛋白少許表達(dá)，IRI組Cathepsin L在大鼠腦缺血再灌注后3h、6h、12h呈上升趨勢，12h達(dá)到高峰，24h下降，均高于Sham組（P﹤0.05）；CLI組各相應(yīng)時間點(diǎn)Cathepsin L蛋白的表達(dá)較IRI組表達(dá)減少（p<0.05）；LY組Cathepsin L表達(dá)在再灌注后3h、6h、12h呈上升趨勢

7、，12h到達(dá)高峰，24h下降，各相應(yīng)時間點(diǎn)Cathepsin L蛋白表達(dá)較 IRI組增加（p<0.05）。Sham組大鼠缺血側(cè)大腦視前區(qū)皮質(zhì)可見p-Akt蛋白少許表達(dá)，IRI組p-Akt蛋白表達(dá)在大鼠腦缺血再灌注后3h達(dá)高峰，6h、12h有下降，24h再度升高；CLI組p-Akt蛋白表達(dá)在再灌注后3h、6h、12h、24h呈持續(xù)增高趨勢，3h、6h較IRI組相應(yīng)時間點(diǎn)減少，12h、24h較IRI組相應(yīng)時間點(diǎn)增高（p<0.05）；LY組p

8、-Akt蛋白表達(dá)在3h達(dá)高峰，6h、12h有下降，24h再度上升，各相應(yīng)時間點(diǎn)較IRI組都有減少（p<0.05）。
　　4.Western blotting檢測各實(shí)驗(yàn)組大鼠缺血側(cè)大腦皮質(zhì)視前區(qū)24h時間點(diǎn)caspase3蛋白表達(dá)：Sham組幾乎不表達(dá)，IRI組、CLI組、LY組明顯表達(dá)，CLI組較IRI組表達(dá)少（P<0.05），LY組較IRI組表達(dá)增加（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.大鼠腦缺血再灌注損傷后，大鼠