TORC1、phospho-CREB和BDNF在實驗性大鼠腦梗死模型中的動態(tài)表達及丹參酮ⅡA腦保護作用的研究.pdf

1、目的:缺血性腦血管病是常見病、多發(fā)病,病死率和致殘率均較高,需要細胞啟動多種防御機制,提高抗凋亡及修復能力,以保護神經(jīng)元免受由此帶來的損傷。目前已知一些轉錄因子與神經(jīng)細胞的存活相關,其中最重要的是環(huán)單磷酸腺苷反應元件結合蛋白(cAMP response element bindingprotein,CREB)家族。CREB在神經(jīng)系統(tǒng)中的功能實現(xiàn),最終依賴于其下游基因在時間和空間上精確的轉錄調控機制。這些基因廣泛參與突觸傳遞、細胞結構、信

2、號轉導、基因轉錄以及代謝等多方面。在一些腦缺血及再灌注模型中,多種應激刺激通過細胞內信號轉導途徑使CREB第133一位的絲氨酸磷酸化而激活。磷酸化的CREB(phosphorylated CREB,phospho-CREB)直接或間接激活相關基因的轉錄,進而表達某些蛋白分子如c-fos、bcl-2以及某些神經(jīng)營養(yǎng)因子如堿性成纖維細胞生長因子、腦源性神經(jīng)生長因子(Brain-Derived Neurotrophic Factor,BDNF

3、)等。這些基因產物調節(jié)著神經(jīng)元在應激性損傷后的再生、存活和修復。盡管CREB可以和其靶基因結合并激活其表達,但激活效應活性較低,往往需要和一些共激活因子相互作用協(xié)調發(fā)揮激活效應。CREB活性調節(jié)轉導子(Transducerso0f regulated CREB,TORCs)是新發(fā)現(xiàn)的一類強有力的CREB的共激活因子。近年來,其對CREB/BDNF通路的調控作用己成為熱點之一。它主要受胞內Ca2+和cAMP的雙重調節(jié),促進了CREB下游基

4、因轉錄的效率和突觸傳遞中的長時程增強效應。因此,TORC1作為TORCs的一個亞型,在缺血性腦血管病中是否同CREB一起共同實現(xiàn)其神經(jīng)保護作用,有待進一步研究,并挖掘其潛在的優(yōu)勢。
　　 丹參酮Ⅱ A(TanshinoneⅡA,TSA)是臨床上常用的中草藥丹參的一種脂溶性有效成分,除了對心肌、腦血管和肝臟的抗炎、抗氧化作用以外,還以其類雌激素生物效治療更年期綜合征等。
　　 本實驗基于成功建立大鼠大腦中動脈閉塞模型,在此

5、基礎上:①測定腦缺血急性期不同時間點大鼠缺血腦皮質中TORC1、phospho-CREB及BDNF的表達水平,以進一步探索TORC1在腦缺血后通過phospho-CREB在促進下游基因表達中的調節(jié)作用；②通過丹參酮Ⅱ A的應用,觀察其對腦含水量、神經(jīng)功能缺損評分、腦梗死體積及TORC1、phospho—CREB及BDNF表達的影響,從而探討TORC1、phospho-CREB及BDNF的表達與腦保護作用之間的關系,及丹參酮ⅡA腦保護作用

6、的可能機制,為臨床治療提供更為有利的理論依據(jù)。
　　 方法:實驗分為兩部分:實驗一,TORC1、phospho-CREB及BDNF在大鼠腦組織中的動態(tài)表達。實驗二,丹參酮Ⅱ A的腦保護作用研究。實驗一,采用成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠,隨機分為正常組(normal)和模型組(middle cerebral artery was occluded,MCAO),參照Longa等的線栓法制作大鼠右側大腦中動脈閉塞模型,

7、分別在術后3 h,6 h,12 h,24 h,48 h,72 h進行評分,2、3、4或5分者納入實驗組,評分完畢將動物斷頭處死,留取病變側腦組織,利用免疫組織化學和蛋白印跡法方法測定TORC1、phospho-CREB及BDNF在蛋白水平的動態(tài)表達。實驗二,采用成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠,隨機分為假手術組(sham)、溶劑對照組(vehicle-control)、丹參酮Ⅱ A小劑量(10 mg/kg)組(TSA—L)及

8、丹參酮Ⅱ A大劑量(20 mg/kg)組(TSA-H)。MCAO術后立刻腹腔注射丹參酮Ⅱ A溶液(10 mg/kg或20 mg/kg),分別在術后24 h時進行評分,完畢將動物斷頭處死,留取病變側腦組織進行腦含水量測定,采用2％2,3,5-三苯基四唑氮紅(triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色觀測梗死體積,免疫組織化學、蛋白印跡法(Western Blot法)和半定量逆轉錄多聚酶鏈反應法(RT-PCR方

9、法)測定TORC1、phospho-CREB及BDNF的表達情況,以及應用激光共聚焦顯微鏡觀測TORC1在不同組間腦皮質神經(jīng)元的表達和核轉導。
　　 結果:
　　 1 MCAO組術后各時間點TORC1、phospho-CREB及BDNF的表達,均分別有兩個高峰,第一個高峰均在腦缺血后3 h,phospho—CREB及BDNF的第二個高峰在缺血后72 h,TORC1的表達和核轉錄的第二個高峰在缺血后48 h。與normal

10、組相比,TORC1,phospho—CREB和BDNF高峰時的表達均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。
　　 2神經(jīng)功能評分:實驗二中,MCAO后24 h采用改良的6分法進行行為學評分。與vehicle—control組相比TSA-H組明顯改善了神經(jīng)功能癥狀缺損(P<<0.05),TSA-L組中沒有觀測到如此明顯的結果。
　　 3腦組織含水量測定:sham組為78.50％±0.7％,vehicle—control組為84.5

11、7％±0.51％,與其相比,TSA-H組降低了腦組織含水量(82.16％±0.63％),且有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。而TSA-L組與對照組比較沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　 4梗死體積的測定:與vehicle-control組(％HLV:43.54％±3.22％)相比,TSA-H組明顯降低了梗死體積(％HLV:34.49％±1.39％),且有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；TSA-L組與vehicle—control組相

12、比,無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。
　　 5丹參酮ⅡA對TORC1、phospho-CREB及BDNF表達的影響:與Vehicle組相比,TSA—H組中TORC1、phospho-CREB及BDNF在蛋白水平表達明顯升高(P<0.05),尤其是TORC1的核積累顯著增加,同樣,TORC1及BDNF在mRNA水平表達也明顯升高(P<0.05)；而TSA-L組表達無此明顯差異。激光共聚焦顯微鏡技術顯示:與Vehicle組比較,TSA

13、—H組中TORC1在神經(jīng)元胞核和細胞質中的聚集反應顯著增加。
　　 結論:TORC1、phospho-CREB及BDNF在大腦中動脈閉塞后早期被誘導表達,TORC1可能僅在腦缺血后48 h前參與了促進了phospho-CREB/BDNF通路的活化。高劑量丹參酮ⅡA干預后,腦含水量降低,梗死體積減小,神經(jīng)功能癥狀缺損評分降低,上調了TORC1、phospho-CREB及BDNF的表達水平,對腦缺血后腦組織有保護作用。本研究提示TO