MCU、MICU1在大鼠腦梗死模型中的作用及機(jī)制.pdf

1、目的:
　　腦梗死是神經(jīng)內(nèi)科常見(jiàn)病、多發(fā)病，病死率及致殘率很高。早期溶栓是急性腦梗死有效的治療方法，但是溶栓治療嚴(yán)格的時(shí)間窗使絕大多數(shù)患者很難在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)到醫(yī)院接受治療。腦梗死后神經(jīng)損傷的病理生理機(jī)制是比較復(fù)雜的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，主要包括興奮性氨基酸毒性、氧化應(yīng)激、炎癥和凋亡等。缺氧時(shí)，谷氨酸興奮毒作用的關(guān)鍵病理過(guò)程之一是鈣離子內(nèi)流引起鈣超載。鈣超載導(dǎo)致一系列鈣依賴(lài)性酶被激活，致使自由基產(chǎn)生增加。從而引起線粒體受損、脂質(zhì)過(guò)氧化、ATP匱

2、乏、ROS產(chǎn)生、核酸斷裂等，最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。線粒體鈣濃度與線粒體能量代謝、膜通透性密切相關(guān)，也會(huì)對(duì)胞漿鈣信號(hào)進(jìn)行修飾進(jìn)而影響細(xì)胞功能。線粒體鈣離子單向轉(zhuǎn)運(yùn)體（Mitochondrial calcium uniporter，MCU）是新近鑒定出的線粒體內(nèi)膜上參與線粒體鈣攝取的重要結(jié)構(gòu)。MICU1(Mitochondrial calcium uptake1)是MCU的調(diào)節(jié)蛋白，其對(duì)MCU的作用是激活還是抑制，尚且存在爭(zhēng)議。由此看來(lái)，這種

3、高度復(fù)雜而精確的調(diào)節(jié)作用仍有待深入研究。新近研究表明MCU參與神經(jīng)細(xì)胞谷氨酸興奮毒，抑制MCU可減少線粒體鈣攝取，保護(hù)線粒體功能從而減少神經(jīng)元死亡。因此我們思考MCU、MICU1與腦梗死的相關(guān)性，能否通過(guò)干預(yù)MICU1與MCU的表達(dá)來(lái)扼制鈣超載從而挽救腦梗死中受損細(xì)胞？這一新的思路研究期望提供一個(gè)腦梗死治療的新靶點(diǎn)。
　　方法:
　　1、采用成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（control）、

4、假手術(shù)組(sham)、大腦中動(dòng)脈栓塞(middle cerebral arteryocclusion，MCAO)組（分為3h、6h、12h、24h、48h、72h六個(gè)時(shí)間點(diǎn)），應(yīng)用Longa等的線栓法建立MCAO大鼠模型。術(shù)后麻醉清醒后對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。在上述不同時(shí)間點(diǎn)將動(dòng)物斷頭處死，用2％2，3，5-三苯基四唑氮紅(triphenyl tetrazolium chloride，TTC)染色法測(cè)算腦梗死體積，用蛋白質(zhì)印跡法(Wes

5、tern Blot)、實(shí)時(shí)定量熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time reverse transcription-quantitative Polymerase Chain Reaction,RT-qPCR)和免疫組化來(lái)觀察MCU、MICU1、cleaved-caspase3的表達(dá)情況，用透射電鏡觀察細(xì)胞及線粒體超微結(jié)構(gòu)變化，用流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測(cè)線粒體功能。
　　2、采用成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠，隨機(jī)分為正常

6、對(duì)照組(control)、假手術(shù)組（sham）、MCAO12h組、尤瑞克林+MCAO組（尤瑞克林0.00875PAN/kg+MCAO）。給藥組動(dòng)物梗死后尾靜脈注射尤瑞克林0.00875PAN/kg，正常對(duì)照組、假手術(shù)組和MCAO組給予等容量生理鹽水。術(shù)后麻醉清醒后對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。梗死后12h大鼠斷頭處死，TTC染色法測(cè)算腦梗死體積，用Westem Blot來(lái)觀察MCU及凋亡蛋白cleaved-caspase3的表達(dá)情況。

7、　　結(jié)果:
　　1、MCAO組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)可見(jiàn)左側(cè)肢體偏癱癥狀，神經(jīng)功能評(píng)分升高(P＜0.05)。TTC染色結(jié)果顯示正常對(duì)照組和假手術(shù)組大鼠腦組織無(wú)白色梗死灶;MCAO組可見(jiàn)右側(cè)大腦半球大面積白色梗死灶。
　　2、Western Blot顯示腦梗死6小時(shí)MCU、MICU1呈上升趨勢(shì)，至梗死后12小時(shí)，MCU、MICU1表達(dá)量達(dá)高峰，Cleaved-caspase3表達(dá)在腦梗死后3、6、12小時(shí)升高顯著（P＜0.05）;免疫組化

8、可見(jiàn)缺血6、12小時(shí)后，MCU、MICU1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較正常對(duì)照組及假手術(shù)組明顯增多Realtime-qPCR顯示MCU在mRNA水平的表達(dá)從梗死后6小時(shí)開(kāi)始升高，至12小時(shí)達(dá)到高峰(P＜0.05)，MICU1在mRNA水平的表達(dá)在梗死后6-12小時(shí)較正常對(duì)照及假手術(shù)組升高顯著(P＜0.05)。
　　3、電鏡下正常對(duì)照組和假手術(shù)組細(xì)胞形態(tài)正常，神經(jīng)元無(wú)水腫，細(xì)胞核核仁明顯，核膜完整，胞漿線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器完整清晰可見(jiàn)。MCAO后

9、3小時(shí)可見(jiàn)腦皮層缺血區(qū)神經(jīng)元胞體腫脹，胞膜完整，線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，核膜模糊，核仁染色質(zhì)輕度溶解;MCAO后12小時(shí)可見(jiàn)胞漿水腫明顯，胞膜溶解，出現(xiàn)大量空泡，線粒體水腫明顯，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)溶解，完整細(xì)胞器少見(jiàn)，核膜溶解。有的神經(jīng)元出現(xiàn)凋亡，表現(xiàn)為核染色質(zhì)邊集，胞體變形，胞核固縮。
　　4、流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)顯示大鼠腦梗死后12-24小時(shí)較正常對(duì)照組及假手術(shù)組線粒體膜電位降低顯著(P＜0.05)。
　　5、尤瑞克林+MCAO組與MCAO

10、12h組相比神經(jīng)功能評(píng)分改善顯著(P＜0.05);TTC染色顯示與MCAO12h組比較，尤瑞克林+MCAO組梗死體積明顯縮小(P＜0.05);Western Blot可見(jiàn)與假手術(shù)組相比，MCAO12h組MCU表達(dá)量顯著增高(P＜0.05)，尤瑞克林+MCAO組MCU表達(dá)量較MCAO組顯著降低(P＜0.05)，尤瑞克林+MCAO組Cleaved-caspase3表達(dá)量較MCAO組及正常對(duì)照均顯著降低(P＜0.05)。
　　結(jié)論:

11、r>　　腦梗死后腦組織中MCU、MICU1蛋白及mRNA水平表達(dá)顯著增高，同時(shí)期cleaved-caspase3表達(dá)增高，細(xì)胞凋亡增多，線粒體膜電位降低，表明MCU、MICU1協(xié)同作用促進(jìn)線粒體鈣攝取，降低線粒體膜電位，導(dǎo)致線粒體功能損傷，引起鈣超載，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，在大鼠腦梗死引起神經(jīng)細(xì)胞損傷的病理生理過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，是腦梗死后神經(jīng)損傷的機(jī)制之一。
　　尤瑞克林能改善神經(jīng)功能缺損狀況，減小腦梗死體積。尤瑞克林神經(jīng)保護(hù)機(jī)