MICU1下調(diào)介導(dǎo)的線粒體鈣攝取障礙在糖尿病心肌病發(fā)生中的作用及機(jī)制.pdf

1、【研究背景】
　　糖尿病是以代謝紊亂為主要特征的一種慢性疾病，其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，嚴(yán)重威脅人類的健康。糖尿病心肌病（DCM）是糖尿病主要的心血管并發(fā)癥之一，更是糖尿病心血管病患者預(yù)后不良的重要原因。DCM主要以心肌左室收縮和（或）舒張功能障礙為特征，若治療不當(dāng)，會(huì)導(dǎo)致心律失常、心源性休克、心力衰竭，嚴(yán)重者甚至發(fā)生猝死。因此，對糖尿病心肌病的發(fā)病機(jī)制及防治措施的研究意義重大。
　　線粒體鈣穩(wěn)態(tài)失衡導(dǎo)致的線粒體功能紊亂被認(rèn)

2、為是糖尿病心肌病發(fā)生的重要病理機(jī)制。但是，糖尿病狀態(tài)下心肌線粒體鈣攝取降低的具體分子機(jī)制至今仍不清楚。近年來陸續(xù)有多篇關(guān)于細(xì)胞線粒體鈣攝取機(jī)制的研究原著發(fā)表在Nature、Cell、Cell Metabolism等高水平雜志上，鑒定出線粒體鈣離子單向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（MCU，mitochondrial calcium uniporter）、線粒體鈣離子攝入蛋白1（MICU1，mitochondrial calcium uptake1）等調(diào)控線粒

3、體鈣攝取的關(guān)鍵分子。MCU定位在線粒體內(nèi)膜形成孔道，而MICU1具有兩個(gè)典型的EF手形結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)可感知鈣離子的變化，可能作為MCU正向調(diào)節(jié)蛋白發(fā)揮作用。有意思的是，研究發(fā)現(xiàn)MICU1功能喪失導(dǎo)致的線粒體鈣紊亂參與兒童特定類型的大腦疾病和肌肉疾病發(fā)生，提示MICU1功能受損與線粒體相關(guān)疾病存在密切關(guān)系。然而，MICU1是否參與了糖尿病心肌線粒體鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)控，進(jìn)而影響糖尿病心肌病的發(fā)生？國內(nèi)外尚未見報(bào)道。
　　因此，本研究旨在闡明M

4、ICU1在糖尿病心肌病中所發(fā)揮的作用，并深入探討其具體機(jī)制，期望為臨床治療糖尿病心肌病提供新的思路。
　　【研究目的】
　　1)明確MICU1在糖尿病心肌病中的表達(dá)變化及在糖尿病心肌病發(fā)展中的作用。
　　2)探討MICU1調(diào)控糖尿病心肌病發(fā)生的分子機(jī)制。
　　3)初步探討MICU1在糖尿病小鼠心臟中表達(dá)下調(diào)的機(jī)制。
　　【研究方法】
　　1.MICU1在糖尿病心肌病中的表達(dá)變化及在糖尿病心肌病發(fā)展中的

5、作用。采用不同周齡db/db糖尿病小鼠和對照組小鼠，通過免疫印跡實(shí)驗(yàn)、實(shí)時(shí)定量PCR及免疫組化方法對MICU1的表達(dá)進(jìn)行檢測。利用心肌點(diǎn)注射腺病毒上調(diào)MICU1的表達(dá)水平。體式熒光顯微鏡驗(yàn)證腺病毒心肌點(diǎn)注射效果同時(shí)評估心臟體積大小，并采用免疫印記方法對MICU1的表達(dá)進(jìn)一步檢測。通過小動(dòng)物超聲檢測小鼠心臟功能，利用免疫印記方法及實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測MICU1及其相關(guān)分子的表達(dá)水平，免疫組化方法檢測其表達(dá)及定位。通過心臟重量、心重/脛骨

6、長度比、心肌橫截面積（CSA）及α-MHC、β-MHC、ANF的mRNA表達(dá)檢測小鼠心肌肥厚。制作冰凍切片，利用mitoSOX染色檢測心肌組織水平ROS的變化。采用免疫印記方法檢測心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白caspase3及caspase9的蛋白表達(dá)。
　　2.MICU1下調(diào)促進(jìn)糖尿病心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究。在H9C2心肌細(xì)胞中，使用高糖高脂培養(yǎng)（33mmol/L葡萄糖+0.5mmol/L棕櫚酸鈉）24h，利用腺病毒及siRNA干涉分別

7、上調(diào)及下調(diào)MICU1的表達(dá)水平后，通過免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白caspase3、caspase9及Cyto-c的蛋白表達(dá)，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)對免疫印記實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。通過TMRM染色檢測心肌細(xì)胞膜電位的改變，在利用線粒體靶向小清蛋白清除線粒體鈣的基礎(chǔ)上，利用線粒體鈣染料Rhod-2對心肌細(xì)胞線粒體鈣攝取能力進(jìn)行檢測，利用mitoSOX染色檢測心肌細(xì)胞水平ROS的改變。利用PDH活性試劑盒，α-KGDH活性檢測試劑盒，N

8、AD+/NADH檢測試劑盒，NADP+/NADPH檢測試劑盒及GSH/GSSG檢測試劑盒檢測心肌細(xì)胞抗氧化能力。
　　3.MICU1在糖尿病小鼠心臟中表達(dá)降低的機(jī)制。
　　利用生物信息學(xué)方法對MICU1的表達(dá)調(diào)控進(jìn)行了初步預(yù)測。利用CHIP實(shí)驗(yàn)對預(yù)測結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證，并在細(xì)胞水平分別上調(diào)和下調(diào)SP1的表達(dá)后檢測MICU1的表達(dá)水平，并檢測db/db糖尿病小鼠心肌組織SP1的表達(dá)，同時(shí)利用GSE數(shù)據(jù)庫中的芯片數(shù)據(jù)分析SP1與MI

9、CU1的相關(guān)性。
　　【研究結(jié)果】
　　1.周齡為6周的db/db糖尿病小鼠心肌組織中MICU1表達(dá)無顯著改變，飼養(yǎng)至12周時(shí)，MICU1的表達(dá)水平顯著低于對照組，且隨著周齡的增大表達(dá)逐漸降低。上調(diào)MICU1的表達(dá)可顯著抑制心肌組織ROS的生成，減輕心肌細(xì)胞凋亡，顯著增強(qiáng)心臟收縮功能，提高α-MHC的表達(dá)表達(dá)水平，同時(shí)降低β-MHC及ANF的表達(dá)水平，減小心肌橫截面積，抑制心肌細(xì)胞肥大，從而顯著延緩糖尿病心肌病的發(fā)展。

10、>　　2.高糖高脂培養(yǎng)H9C2心肌細(xì)胞系24h后可顯著下調(diào)MICU1的表達(dá)。下調(diào)MICU1的表達(dá)會(huì)顯著降低線粒體鈣攝取能力，降低心肌細(xì)胞線粒體膜電位，增加ROS的生成，促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡。反之，上調(diào)MICU1可提高線粒體鈣攝取能力，提高心肌細(xì)胞線粒體膜電位，抑制心肌細(xì)胞線粒體ROS的生成進(jìn)而抑制心肌細(xì)胞凋亡。
　　3.生物信息學(xué)分析預(yù)測MICU1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子為SP1。CHIP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在MICU1第一個(gè)外顯子前1個(gè)堿基的位置，SP1

11、與MICU1發(fā)生特異性結(jié)合。在細(xì)胞水平分別上調(diào)和下調(diào)SP1的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)MICU1的表達(dá)隨SP1的改變而改變，通過檢測db/db糖尿病小鼠心肌組織SP1的表達(dá)發(fā)現(xiàn)在6周齡時(shí)表達(dá)無變化，飼養(yǎng)至12周時(shí)SP1的表達(dá)較對照組出現(xiàn)顯著降低，且隨周齡增長表達(dá)逐漸下降，與MICU1在db/db糖尿病小鼠心肌中的表達(dá)趨勢相一致，同時(shí)利用GSE數(shù)據(jù)庫中的芯片分析發(fā)現(xiàn)SP1與MICU1的表達(dá)呈正相關(guān)。
　　【結(jié)論】
　　1.發(fā)現(xiàn)MICU1在糖尿

12、病心肌中表達(dá)降低，并隨著糖尿病心肌病加重其表達(dá)進(jìn)一步下降。在db/db糖尿病小鼠心肌中上調(diào)MICU1的表達(dá)可顯著降低心肌細(xì)胞橫截面積，減輕心臟重量及降低心重/脛骨長度比值，從而顯著延緩糖尿病心肌病心肌肥厚的發(fā)展。同時(shí)上調(diào)MICU1的表達(dá)可抑制心肌組織ROS生成，降低心肌細(xì)胞的凋亡。
　　2.MICU1可通過增強(qiáng)線粒體鈣攝取能力抑制心肌細(xì)胞線粒體ROS的生成進(jìn)而減輕高糖高脂引起的心肌細(xì)胞凋亡。
　　3.糖尿病心肌MICU1的表