瑞替加濱對實驗性腦梗死小鼠的腦保護作用：下調(diào)calpain-1、Bax,上調(diào)Bcl-2的表達.pdf

1、缺血性腦卒中是最常見的腦卒中類型，也是成人死亡和殘疾的主要原因之一。腦缺血后繼發(fā)性腦損傷是一個涉及炎癥、氧化應激、鈣超載、興奮性氨基酸中毒、細胞凋亡等一系列復雜因素的級聯(lián)過程，這些因素相互影響，形成對腦組織的二次打擊，成為病情加重的主要原因。因此，若以上述級聯(lián)反應的關(guān)鍵環(huán)節(jié)為靶點，抑制缺血半暗帶細胞的漸進性死亡，可能發(fā)揮腦保護作用，具有潛在的臨床應用價值。
　　瑞替加濱(retigabine,RTG)目前作為成人部分型癲癇發(fā)作的輔

2、助用藥，具有穩(wěn)定神經(jīng)元靜息膜電位、抗興奮性等特點。除了作為新型抗癲癇藥物，瑞替加濱對神經(jīng)性疼痛、神經(jīng)退行性病變、肌張力障礙等疾病也具有潛在的臨床治療價值，同時，在培養(yǎng)的海馬腦片上使用血清剝奪和血氧剝奪的方法，瑞替加濱可發(fā)揮抗氧化作用減少細胞的死亡。我們假設(shè)在缺血性腦卒中發(fā)生后瑞替加濱通過限制神經(jīng)元放電活動保存細胞能量，減輕缺血情況下的腦損傷。
　　缺血性腦組織死亡方式除了細胞壞死還包括細胞凋亡。缺血性腦卒中發(fā)生后，損傷相對較輕的半

3、暗帶區(qū)域的細胞可能經(jīng)歷著由基因調(diào)控的自主有序的死亡，即細胞凋亡。氧化應激損傷、過度炎癥反應、谷氨酸大量釋放、鈣超載等均有可能觸發(fā)細胞凋亡信號使細胞產(chǎn)生“自殺”行為。凋亡的細胞在凋亡性核酸內(nèi)切酶的作用下細胞的 DNA被降解，形成凋亡小體。研究表明，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase）家族成員之一caspase-3是主要的凋亡“執(zhí)行者”，其活化后可以裂解多種

4、功能蛋白質(zhì)導致細胞凋亡。缺血性腦卒中發(fā)生后 caspase在腦中的表達水平升高，抑制 caspase的活化可以減輕缺血性損傷發(fā)揮腦保護作用。
　　細胞凋亡的過程涉及到很多促凋亡相關(guān)因子的表達及抗凋亡相關(guān)因子的抑制。缺血性腦卒中發(fā)生后，促凋亡蛋白 Bax在腦中的表達水平升高。抑制 Bax或過表達抗凋亡蛋白 Bcl-2可以減輕缺血性損傷發(fā)揮腦保護作用。鈣蛋白酶（calpain）是一類鈣依賴的半胱氨酸肽鏈內(nèi)切酶的總稱，可以感受細胞內(nèi)升高

5、的鈣離子濃度而被激活，并通過多種途徑引起細胞凋亡。calpain還可以裂解抗凋亡蛋白 Bcl-2促進細胞凋亡，抑制calpain的活性也能發(fā)揮腦保護作用。
　　本研究采用健康成年雄性 CD-1小鼠為研究對象，通過線栓法建立小鼠永久性大腦中動脈閉塞模型，給予瑞替加濱干預后，通過神經(jīng)功能缺損評分、腦梗死體積及腦組織含水量測定，觀察瑞替加濱對實驗性腦梗死小鼠是否具有腦保護作用；通過測定小鼠缺血半暗帶細胞核 DNA斷裂的情況及 cleav

6、ed caspase-3的蛋白表達水平觀察瑞替加濱對實驗性腦梗死小鼠腦組織凋亡的影響；通過測定小鼠缺血后腦皮層 Bax、calpain-1及 Bcl-2的表達情況觀察瑞替加濱對實驗性腦梗死小鼠腦組織中促凋亡、抗凋亡因子的影響，探討其可能的相關(guān)作用機制，為瑞替加濱的進一步研究及臨床應用提供理論支持和實驗依據(jù)。本研究分為三部分，各部分內(nèi)容概述如下。
　　第一部分瑞替加濱對實驗性腦梗死小鼠的腦保護作用
　　目的：通過對瑞替加濱干預

7、后實驗性腦梗死小鼠的神經(jīng)功能缺損評分、腦梗死體積及腦組織含水量測定，觀察瑞替加濱對實驗性腦梗死小鼠的腦保護作用。
　　方法：
　　1采用健康成年雄性 CD-1小鼠為研究對象，通過線栓法建立小鼠永久性大腦中動脈閉塞模型。將 CD-1小鼠隨機分為5組：假手術(shù)組（ Sham）、大腦中動脈閉塞組（ MCAO）、瑞替加濱低劑量組（ RTG5）、瑞替加濱中劑量組（ RTG10）及瑞替加濱高劑量組（RTG20）。假手術(shù)組小鼠接受假手術(shù)操作

8、后1小時腹腔注射等量生理鹽水；大腦中動脈閉塞組小鼠接受線栓法大腦中動脈閉塞手術(shù)后1小時腹腔注射等量生理鹽水；瑞替加濱低劑量組小鼠接受線栓法大腦中動脈閉塞手術(shù)后1小時腹腔注射瑞替加濱5mg/kg；瑞替加濱中劑量組小鼠接受線栓法大腦中動脈閉塞手術(shù)后1小時腹腔注射瑞替加濱10mg/kg；瑞替加濱高劑量組小鼠接受線栓法大腦中動脈閉塞手術(shù)后1小時腹腔注射瑞替加濱15mg/kg。各組小鼠于手術(shù)造模后24小時進行神經(jīng)功能缺損評分，2,3,5-氯化三苯

9、基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色測定腦梗死體積，干濕重法測定腦組織含水量。
　　2為進一步探討瑞替加濱對實驗性腦梗死小鼠的腦保護作用時間窗，我們也觀察了在腦缺血發(fā)生后不同時間給予瑞替加濱干預對小鼠缺血性腦損傷的影響。將 CD-1小鼠隨機分為5組：大腦中動脈閉塞組（MCAO）、瑞替加濱缺血后即刻用藥組（RTG-0h）、瑞替加濱缺血后1小時用藥組(RTG-1h)、瑞替加濱缺

10、血后2小時用藥組（RTG-2h）、瑞替加濱缺血后3小時用藥組（RTG-3h）。大腦中動脈閉塞組小鼠接受線栓法大腦中動脈閉塞手術(shù)；瑞替加濱缺血后即刻用藥組小鼠接受線栓法大腦中動脈閉塞手術(shù)后即刻腹腔注射瑞替加濱10mg/kg；瑞替加濱缺血后1小時用藥組小鼠接受線栓法大腦中動脈閉塞手術(shù)后1小時腹腔注射瑞替加濱10mg/kg；瑞替加濱缺血后2小時用藥組小鼠接受線栓法大腦中動脈閉塞手術(shù)后2小時腹腔注射瑞替加濱10mg/kg；瑞替加濱缺血后3小時用

11、藥組小鼠接受線栓法大腦中動脈閉塞手術(shù)后3小時腹腔注射瑞替加濱10mg/kg；各組小鼠在不需要瑞替加濱干預的各個時間點均腹腔注射等量的生理鹽水。各組小鼠于手術(shù)造模后24小時 TTC染色測定腦梗死體積。
　　結(jié)果：
　　1 Sham組小鼠的神經(jīng)功能缺損評分均為0，MCAO組小鼠則明顯高于 Sham組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05)；與 MCAO組小鼠相比， RTG5組和 RTG10組小鼠的神經(jīng)功能缺損評分明顯降低，差異有統(tǒng)計學

12、意義（P<0.05)；RTG15組小鼠神經(jīng)功能缺損評分較MCAO組小鼠無明顯改變，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05)。
　　2 Sham組小鼠腦片 TTC染色后呈現(xiàn)均勻一致的紅色，MCAO組小鼠腦片 TTC染色后在右側(cè)皮層及基底節(jié)區(qū)呈現(xiàn)大范圍的白色梗死區(qū)域。與 MCAO組小鼠相比， RTG5組和 RTG10組小鼠的梗死體積明顯減小，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05)；RTG15組小鼠的梗死體積較MCAO組小鼠無明顯改變，差異無統(tǒng)計學意

13、義（P>0.05)。
　　3腦組織含水量測定結(jié)果顯示：與 MCAO組小鼠相比，RTG5組和RTG10組小鼠的腦組織含水量明顯減小，差異有統(tǒng)計學意義（ P<0.05)；RTG15組小鼠的腦組織含水量較 MCAO組小鼠無明顯改變，差異無統(tǒng)計學意義（ P>0.05)。上述結(jié)果表明瑞替加濱給藥劑量在5mg/kg、10mg/kg時均能夠較好的發(fā)揮腦保護作用，接下來的實驗我們將主要關(guān)注瑞替加濱在10mg/kg時的相關(guān)作用及機制。
　　4

14、與 MCAO組小鼠相比，RTG-0h組、RTG-1h組、RTG-2h組及RTG-3h組小鼠的梗死體積明顯減小，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05)。RTG-0h組、RTG-1h組、RTG-2h組及RTG-h3組小鼠的梗死體積相互比較沒有明顯改變，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05)。上述結(jié)果表明瑞替加濱10mg/kg在缺血發(fā)生后0-3小時給藥均能發(fā)揮腦保護作用。
　　第二部分瑞替加濱對實驗性腦梗死小鼠腦組織細胞凋亡的影響
　　目的：

15、通過測定小鼠缺血后半暗帶腦細胞核 DNA斷裂的情況及cleaved caspase-3的蛋白表達水平觀察瑞替加濱對實驗性腦梗死小鼠腦細胞凋亡的影響。
　　方法：采用健康成年雄性 CD-1小鼠為研究對象，通過線栓法建立小鼠永久性大腦中動脈閉塞模型。將 CD-1小鼠隨機分為3組：假手術(shù)組（ Sham）、大腦中動脈閉塞組（ MCAO）、瑞替加濱干預組（RTG）。假手術(shù)組小鼠接受假手術(shù)操作后1小時腹腔注射等量生理鹽水；大腦中動脈閉塞組小鼠

16、接受線栓法大腦中動脈閉塞手術(shù)后1小時腹腔注射等量生理鹽水；瑞替加濱組小鼠接受線栓法大腦中動脈閉塞手術(shù)后1小時腹腔注射瑞替加濱10mg/kg。各組小鼠于手術(shù)造模后24小時TUNEL試劑盒檢測半暗帶區(qū)域腦細胞核 DNA斷裂的情況，Western-blot法檢測cleaved caspase-3蛋白表達情況。
　　結(jié)果：
　　1與 Sham組相比，MCAO組小鼠腦組織切片的 TUNEL陽性細胞數(shù)明顯高于Sham組，差異有統(tǒng)計學意義

17、（P<0.05)；與MCAO組小鼠相比，RTG組小鼠腦組織切片的TUNEL陽性細胞數(shù)明顯低于MCAO組小鼠，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05)。
　　2各組小鼠均有 cleaved caspase-3蛋白的表達；與 Sham組相比， MCAO組小鼠的cleaved caspase-3表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05)；與MCAO組小鼠相比，RTG組小鼠的cleaved caspase-3表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P

18、<0.05)。
　　第三部分瑞替加濱下調(diào)實驗性腦梗死小鼠腦組織 calpain-1、Bax，上調(diào)Bcl-2的表達
　　目的：通過測定實驗性腦梗死小鼠腦皮層calpain-1、Bax及Bcl-2的表達情況觀察瑞替加濱對缺血腦細胞促凋亡、抗凋亡因子的影響，探討其抑制缺血性腦細胞凋亡可能的作用機制。
　　方法：采用健康成年雄性 CD-1小鼠為研究對象，通過線栓法建立小鼠永久性大腦中動脈閉塞模型。將 CD-1小鼠隨機分為3組：

19、假手術(shù)組（ Sham）、大腦中動脈閉塞組（ MCAO）、瑞替加濱干預組（RTG）。假手術(shù)組小鼠接受假手術(shù)操作后1小時腹腔注射等量生理鹽水；大腦中動脈閉塞組小鼠接受線栓法大腦中動脈閉塞手術(shù)后1小時腹腔注射等量生理鹽水；瑞替加濱組小鼠接受線栓法大腦中動脈閉塞手術(shù)后1小時腹腔注射瑞替加濱10mg/kg。各組小鼠于手術(shù)造模后24小時qRT-PCR檢測 calpain-1、Bax、Bcl-2的 mRNA表達情況，Western-blot法及免疫組

20、織化學法檢測calpain-1、Bax、Bcl-2蛋白表達情況。
　　結(jié)果：
　　1 qRT-PCR結(jié)果顯示：與 Sham組相比，MCAO組小鼠的 calpain-1、Bax的 mRNA表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（ P<0.05)；與MCAO組小鼠相比，RTG組小鼠的calpain-1、Bax的mRNA表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05)；與MCAO組小鼠相比，RTG組小鼠的Bcl-2的mRNA表達明顯升高，差

21、異有統(tǒng)計學意義（P<0.05)。
　　2 Western-blot結(jié)果顯示：各組小鼠均有calpain-1、Bax、Bcl-2蛋白的表達。與 Sham組相比，MCAO組小鼠的 calpain-1、Bax蛋白表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05)；與MCAO組小鼠相比，RTG組小鼠的 calpain-1、Bax蛋白表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（ P<0.05)；與MCAO組小鼠相比，RTG組小鼠的Bcl-2蛋白表達明顯升高

22、，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05)。
　　3免疫組織化學結(jié)果顯示：各組小鼠均有 calpain-1、Bax、Bcl-2陽性細胞。與 Sham組相比，MCAO組小鼠的 calpain-1、Bax陽性細胞數(shù)升高；與MCAO組小鼠相比，RTG組小鼠的calpain-1、Bax陽性細胞數(shù)降低；與MCAO組小鼠相比，RTG組小鼠的Bcl-2陽性細胞數(shù)升高。
　　結(jié)論：
　　1本實驗通過線栓法成功建立小鼠永久性右側(cè)大腦中動脈閉塞模

23、型，發(fā)現(xiàn)模型建立后1小時腹腔注射瑞替加濱5mg/kg、10mg/kg可以顯著降低小鼠的神經(jīng)功能缺損評分及腦梗死體積，且以該劑量于局灶性腦缺血發(fā)生后0-3小時給藥均能發(fā)揮腦保護作用，為進一步研究瑞替加濱腦保護作用的治療時間窗提供了實驗依據(jù)。
　　2瑞替加濱干預可以降低實驗性腦梗死小鼠腦組織切片的 TUNEL陽性細胞數(shù)，抑制腦細胞核 DNA的斷裂；還可以降低實驗性腦梗死小鼠 cleaved caspase-3蛋白的表達，抑制 casp