神經(jīng)生長因子基因修飾的許旺細胞治療大鼠脊髓損傷的療效觀察及其機制研究.pdf

1、本文主要分三部分進行了介紹：
　　第一部分
　　許旺細胞的取材、純化和鑒定
　　目的:培養(yǎng)并純化大鼠許旺細胞,為后續(xù)的實驗提供細胞來源。
　　方法:取新生3-4天 SD大鼠的坐骨神經(jīng)和臂叢神經(jīng),采用IV型膠原酶消化的半植塊培養(yǎng)法獲取原代大鼠許旺細胞;然后用免疫磁珠分選法獲純化許旺細胞。用S-100抗體進行免疫組織化學染色鑒定許旺細胞并計算細胞純度。
　　結果:取材后6-8小時可見到細胞貼壁,呈現(xiàn)出明顯的梭形

2、,遮光性強。免疫磁珠分選后可獲得了高純度的許旺細胞,免疫細胞化學染色見到大量的陽性細胞,陽性率達到95％以上。
　　結論:胰酶和膠原酶聯(lián)合消化法聯(lián)合磁珠分選法可以獲得高純度的許旺細胞,為后續(xù)的實驗提供了細胞來源。
　　第二部分
　　神經(jīng)生長因子基因載體的構建、轉染及表達
　　目的:構建綠色熒光蛋白標記的神經(jīng)生長因子基因表達載體,并檢測其表達效率。
　　方法:采用雙酶切法切取人神經(jīng)生長因子基因序列,采用PCR

3、法擴增,酶切后和載體EGFP-N1連接;感染感受態(tài)大腸桿菌后挑選單克隆菌株,提取質粒酶切鑒定證實為目的質粒后進行擴增。用lipofectamine2000將質粒轉染大鼠許旺細胞,用ELISA法檢測神經(jīng)生長因子表達量的變化。
　　結果:PCR凝膠電泳結果顯示切取的片段約為750bp左右,和目的基因片段大小相符合;提取質粒后雙酶切顯示切取片段和目的基因的大小相符合;轉然后24小時在顯微鏡下可見到明顯的綠色熒光,一周后上清液中NGF的含

4、量較對照組明顯升高。
　　結論:成功構建出含有神經(jīng)生長因子基因的EGFP-N1質粒,轉染許旺細胞后能夠促進NGF的表達。
　　第三部分
　　高表達 NGF的許旺細胞移植治療脊髓損傷的療效及其機制探討
　　目的:觀察高表 NG的許旺細胞移植治療大鼠脊髓損傷的效果,并探討其作用的可能機制。
　　方法:用改良 Allen法制備大鼠脊髓損傷模型,隨機分為 A、B、C、D四組,A組為轉染含 NGF基因的許旺細胞移植組

5、,B組為許旺細胞移植組,C組為 PBS對照組,D組為假手術組,造模一周后分別用108/ml含有轉染 NGF的許旺細胞的PBS液、108/ml許旺細胞的PBS液、PBS液注入 A、B、C組大鼠脊髓損傷部位及其上下各5μl。注射后一、二、三、四周分別用BBB評分法觀察大鼠雙下肢運動功能,用肌電圖檢測大鼠的神經(jīng)傳導功能;處死后用免疫組織化學染色法檢測脊髓損傷部位 Bcl-2和GAP-43的表達變化。并取轉染組的大鼠脊髓組織行縱行切片觀察許旺細

6、胞的遷移情況。
　　結果:各時間點 BBB評分結果顯示 D組>A組>B組>C組;肌電圖檢測結果顯示中樞潛伏時傳導速度 A、B、C組間差別有統(tǒng)計學意義 P<0.05,中樞波幅 A、B、C組間未見明顯差異(P>0.05),D組明顯高于其它三組; Bcl-2和GAP-43免疫組化檢測結果提示 A>B>C組,D組僅有少量表達。大鼠脊髓組織縱行切片觀察顯示在脊髓損傷后一周損傷區(qū)有大量的綠色熒光蛋白表達,隨后隨著時間的延長,大鼠脊髓損傷區(qū)內(nèi)的