K-RAS基因6種突變型細(xì)胞株的構(gòu)建與鑒定.pdf

1、K-RAS蛋白屬于RAS蛋白家族中的一員，當(dāng)EGFR或其他酪氨酸激酶受體在胞外信號(hào)分子刺激下激活后，RAS蛋白從與GDP結(jié)合的無(wú)活性形式轉(zhuǎn)變成與GTP結(jié)合的有活性形式，繼續(xù)激活RAF-MAPK及PI3K/AKT等信號(hào)通路，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡、代謝及血管生成的調(diào)節(jié)。突變的RAS基因?qū)е翿AS蛋白的GTP酶活性降低，使其處于與GTP結(jié)合的持續(xù)激活狀態(tài)，從而使正常細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化成并形成腫瘤。KRAS基因是結(jié)直腸癌中突變頻率最高的基因，

2、其不同的突變類型與結(jié)直腸癌的分期及預(yù)后相關(guān)。此外，KRAS突變與轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌治療中抗表皮生長(zhǎng)因子受體單克隆抗體（anti-EGFR mAb）的耐藥性相關(guān)，然而其具體機(jī)制尚不明確。最近臨床研究發(fā)現(xiàn)并非所有KRAS突變類型的生物學(xué)效應(yīng)都相似，與第12密碼子各種突變不同，G13D突變的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者仍能從抗EGFR單抗的治療中獲益。該結(jié)果仍需體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證，并探究其發(fā)生機(jī)制。為了進(jìn)一步研究KRAS基因上述突變?cè)诮Y(jié)直腸癌預(yù)后及治療

3、中的作用，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)這些突變的結(jié)直腸癌細(xì)胞株成為首要任務(wù)。本研究通過(guò)構(gòu)建野生型及G12D、G12V、G12A、G12S，G13D和Q61H共6種突變型KRAS重組慢病毒載體，并包裝沉淀成慢病毒顆粒感染結(jié)腸癌細(xì)胞株CACO-2。經(jīng)Pull down、Western blot實(shí)驗(yàn)及cDNA測(cè)序，證實(shí)感染后細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)野生型及上述6種突變型KRAS基因。為進(jìn)一步研究KRAS基因不同突變的生物學(xué)特性奠定了基礎(chǔ)。
　　目的:構(gòu)建野生型及6

4、種突變型KRAS基因重組慢病毒載體，并包裝沉淀慢病毒顆粒，感染結(jié)腸癌細(xì)胞株CACO-2，采用Pull down、Western blot實(shí)驗(yàn)及cDNA測(cè)序鑒定穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。從而為下一步研究KRAS基因不同突變?cè)诮Y(jié)直腸癌治療及預(yù)后中的作用提供重要的工具。
　　方法:
　　1.通過(guò)RT-PCR從人結(jié)腸癌細(xì)胞株CACO-2中擴(kuò)增野生型KRAS基因，并將該基因連接到慢病毒表達(dá)載體。
　　2.以野生型KRAS基因?yàn)槟０澹枚?/p>

5、點(diǎn)突變PCR技術(shù)構(gòu)建G12D、G12V、G12A、G12S，G13D和Q61H共6種突變型KRAS基因重組慢病毒載體。
　　3.經(jīng)293T細(xì)胞包裝沉淀慢病毒顆粒及滴度測(cè)定后，感染人結(jié)腸癌細(xì)胞株CACO-2，成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)野生型及上述6種突變型KRAS基因的細(xì)胞株。通過(guò)cDNA測(cè)序證實(shí)突變KRAS基因的表達(dá)，并根據(jù)突變型KRAS蛋白的持續(xù)激活狀態(tài)經(jīng)Pull down及Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)其蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:經(jīng)

6、測(cè)序鑒定成功構(gòu)建野生型KRAS基因重組慢病毒表達(dá)載體pCDF-KRAS-WT，通過(guò)定點(diǎn)突變PCR技術(shù)成功構(gòu)建pCDF-KRAS-G12D、pCDF-KRAS-G12V、pCDF-KRAS-G12A、pCDF-KRAS-G12S、 pCDF-KRAS-G13D、pCDF-KRAS-G61H共6種突變型KRAS基因重組慢病毒載體。病毒載體包裝沉淀成病毒顆粒感染CACO-2細(xì)胞后，經(jīng)Pull down及Western blot實(shí)驗(yàn)及cDNA測(cè)

7、序證實(shí)感染后的細(xì)胞株CACO-2-WT、CACO-2-G12D、CACO-2-G12V、CACO-2-G12A、CACO-2-G12S、CACO-2-G13D、CACO-2-G61H穩(wěn)定表達(dá)野生型及上述6種突變型KRAS基因。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建了野生型及6種突變型KRAS基因重組慢病毒載體，包裝沉淀成慢病毒顆粒并測(cè)定滴度后感染結(jié)腸癌細(xì)胞CACO-2，經(jīng)鑒定成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)野生型及6種突變型KRAS基因的CACO-2細(xì)胞株。為進(jìn)一