斑馬魚G6PD酶活性的測定及突變型g6pd基因質粒的構建.pdf

1、目的：檢測斑馬魚不同組織、不同時相胚胎的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD）酶活性。構建g6pd-pCS2+、mutant g6pd-pCS2+、g6pd-EGFP-pCS2+、mutant g6pd-EGFP-pCS2+重組質粒。觀察斑馬魚中g6pd的表達情況，為構建G6PD缺乏癥的斑馬魚疾病模型奠定基礎。
　　方法1．運用改良的G6PD定量比值法檢測成年斑馬魚各

2、組織以及不同時相的胚胎中G6PD酶活性；2．重組質粒的構建：（1）提取野生型斑馬魚Total RNA，將RNA逆轉錄為斑馬魚cDNA，通過RT-PCR法克隆得到斑馬魚g6pd基因全長，將g6pd基因與pCS2+空載體連接獲得g6pd-pCS2+重組質粒；（2）利用g6pd-pCS2+重組質粒制備地高辛標記的反義mRNA探針，在野生型斑馬魚Tuebingen進行原位雜交，觀察g6pd基因的表達情況；（3）g6pd-pCS2+重組質粒鑒定正

3、確后，運用重疊延伸定點誘變原理設計出突變型mutant g6pd基因，將mutant g6pd基因與EGFP-pCS2+質粒重組構建突變型mutant g6pd-EGFP-pCS2+重組質粒。3．利用RT-PCR檢測成年斑馬魚各組織以及不同時相的胚胎g6pd基因mRNA水平表達情況；4．利用顯微注射技術將mutant g6pd-EGFP-pCS2+重組質粒注入斑馬魚胚胎中，觀察綠色熒光蛋白的表達。結果1．用改良的G6PD定量比值法檢測野

4、生型成年斑馬魚腦、眼睛、魚鰓、腸、肌肉、皮膚以及血等各組織G6PD酶活性，結果為：腦1.7307±0.1673、眼睛1.7085±0.2230、魚鰓1.7347±0.1901、腸1.7501±0.2241、肌肉1.7201±0.1573、皮膚1.7460±0.1756、血1.7012±0.1902，斑馬魚體積較小，血量較少，但本研究發(fā)現(xiàn)在斑馬魚的各個組織當中同樣能夠檢測斑馬魚的酶活性。同時利用相同的方法檢測斑馬魚胚胎各時相的酶活性，包括

5、24小時、48小時、5天、15天，檢測結果如下：24小時1.7429±0.1701、48小時1.7495±0.1296、5天1.7118±0.2236、15天1.7621±0.1690。2．成功設計突變體mutant g6pd基因；3．構建g6pd-EGFP-pCS2+、突變型mutant g6pd-EGFP-pCS2+重組質粒；4．制備出斑馬魚g6pd基因反義mRNA探針；5．將mutant g6pd-EGFP-pCS2+重組質粒顯微

6、注射入斑馬魚胚胎內，在熒光顯微鏡下觀察到熒光表達情況。結論1．本研究采用改良的G6PD定量比值法在野生型斑馬魚中檢測各個組織及各個時相胚胎的G6PD酶活性，首次建立了檢測斑馬魚G6PD酶活性的技術。2．本研究所得的結果提示斑馬魚中不同組織以及不同的胚胎酶活性檢測結果無顯著差異，通過在斑馬魚中檢測不同組織及不同時相胚胎的G6PD酶活性，在斑馬魚中建立了G6PD酶活性的標準值。3．本研究采用新型模式生物斑馬魚，首次通過原位雜交觀察g6pd基