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文檔簡介
1、目的:葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD),是哺乳動(dòng)物中一個(gè)重要的看家酶;在磷酸戊糖途徑中為首個(gè)限速酶,廣泛分布于全身各組織細(xì)胞內(nèi)。G6PD是機(jī)體正常的新陳代謝和生長發(fā)育過程中必不可少的一種酶;對維持胞漿池的NADPH和細(xì)胞的氧化還原平衡是不可缺少的。G6PD基因突變會造成G6PD蛋白部分功能的缺失,可導(dǎo)致新生兒黃疸,藥物或感染介導(dǎo)的溶血危象,蠶豆病等。最近的研究顯示G6PD在細(xì)胞和生物體的生理機(jī)能等方面具有重要作用。G6PD活性缺失,會
2、干擾氧化還原的平衡狀態(tài),可導(dǎo)致細(xì)胞生長失調(diào)和信號傳導(dǎo)異常,還會出現(xiàn)胚胎發(fā)育異常,增加退化性疾病的易感性等。但到目前為止,細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí),G6PD的活性變化以及與磷酸戊糖途徑的關(guān)系尚不清楚,因此,研究G6PD的活性變化對了解如何維持細(xì)胞內(nèi)NADPH和細(xì)胞的氧化還原平衡狀態(tài)以及相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制都具有十分重要的意義。
人類的G6PD基因是一個(gè)X連鎖遺傳基因,位于Xq28區(qū)域,包含有13個(gè)外顯子和12個(gè)內(nèi)含子,長約有21kb
3、。第一個(gè)外顯子沒有編碼序列,位于第2和3外顯子中間的內(nèi)含子長約9kb。
血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是由血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化生成的多肽(八肽)物質(zhì);是腎素—血管緊張素系統(tǒng)RAS中最為重要的活性物質(zhì)。RAS在維持機(jī)體血壓穩(wěn)定及調(diào)節(jié)水、電解質(zhì)平衡中發(fā)揮了重要作用。RAS活性的變化與心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展具有密切相關(guān)性。在動(dòng)脈硬化的發(fā)生、發(fā)展過程中,AngⅡ通過多種效應(yīng)參與。AngⅡ刺激導(dǎo)致血管產(chǎn)生過量的自由基,進(jìn)一步導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,
4、發(fā)生炎癥反應(yīng)和功能障礙,成為動(dòng)脈粥樣硬化的基礎(chǔ)。但是血管內(nèi)皮細(xì)胞在處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí),細(xì)胞內(nèi)會出現(xiàn)什么樣的變化?G6PD活性會有怎樣變化以及與磷酸戊糖途徑又有什么關(guān)系,尚不清楚。
基于上述情況,本實(shí)驗(yàn)選用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(HUVEC)作為研究對象,使用AngⅡ刺激細(xì)胞復(fù)制氧化應(yīng)激的模型,觀察細(xì)胞內(nèi)一氧化氮合酶(NOS)、一氧化氮(NO)、NADP/NADPH及G6PD蛋白的變化。對AngⅡ致HUVEC的氧化應(yīng)激時(shí),G6PD的
5、變化以及與磷酸戊糖途徑的關(guān)系進(jìn)行研究。
方法:
1.細(xì)胞培養(yǎng)
人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株用含有100μg/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素、10% FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基,置37℃,5% CO2及飽和濕度下培養(yǎng)24小時(shí),換用無血清的DMEM培養(yǎng)基再培養(yǎng)24小時(shí)。然后換用含有刺激因素和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)至所需時(shí)間后,收集細(xì)胞或上清液用于以下實(shí)驗(yàn)。
2.活性氧(ROS)的檢測
6、(1)分別給予細(xì)胞0,10-6,10-7,10-8mmol/L AngⅡ刺激,作用相同的時(shí)間1h后,采用活性氧檢測試劑盒對不同濃度產(chǎn)生的活性氧進(jìn)行檢測。
(2)用相同濃度10-6mmol/L的AngⅡ,分別給予細(xì)胞0h,0.5 h,1h,3h的刺激后,采用活性氧檢測試劑盒對不同時(shí)間產(chǎn)生的活性氧進(jìn)行檢測。
3.NADP/NADPH的變化檢測
給予細(xì)胞相同濃度(10-6mmol/L)AngⅡ的刺激后,分別作用0
7、 min,5min,15min,30min,60min,90min,120min后收取細(xì)胞,按試劑盒說明書熔煉細(xì)胞2次,進(jìn)行測定。
4.G6PD活性變化測定
給予細(xì)胞相同濃度(10-6mmol/L)AngⅡ的刺激后,分別作用0 min,5min,15min,30min,60min,90min,120min后收取細(xì)胞,裂解蛋白并定量,凍于-70℃。按試劑盒說明書進(jìn)行測定。
5.G6PD蛋白表達(dá)變化檢測
8、 給予細(xì)胞相同濃度(10-6mmol/L)AngⅡ的刺激后,分別作用0 min,5min,15min,30min,60min,90min,120min后收取細(xì)胞,提取蛋白,Western Blotting對G6PD進(jìn)行測定。
6.NOS及NO的檢測
(1)分別給予細(xì)胞0 min,5min,15min,30min,60min,90min,120min用相同濃度10-6mmol/L的AngⅡ的刺激后,收取細(xì)胞上清液,采
9、用NO試劑盒進(jìn)行檢測。
(2)分別給予細(xì)胞0 min,5min,15min,30min,60min,90min,120min用相同濃度10-6mmol/L的AngⅡ的刺激后,收取細(xì)胞上清液,采用NOS試劑盒進(jìn)行檢測。
7.數(shù)據(jù)處理
所有數(shù)據(jù)均用(X)±S表示,采用SPSS16.0軟件進(jìn)行處理,對所測定結(jié)果進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn),多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析(oneway ANOVA),以P<0.05為
10、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)果:
1.AngⅡ刺激HUVEC后ROS的產(chǎn)生增多。
(1)不同濃度的AngⅡ(0,10-6,10-7,10-8mmol/L)刺激細(xì)胞1h后,熒光顯微鏡下觀察,以10-6mmol/L時(shí)熒光強(qiáng)度最強(qiáng)。
(2)用10-6mmol/L AngⅡ刺激細(xì)胞0h,0.5h,1h,3h,6h后,熒光顯微鏡下觀察,以1h時(shí)熒光強(qiáng)度最強(qiáng)。
2.HUVEC氧化應(yīng)激發(fā)生發(fā)展過程中NADP
11、/NADPH(Ratio)逐步下降。
用10-6mmol/L AngⅡ分別給予細(xì)胞0 min,5min,15min,30min,60min,90min,120min刺激后:
隨著時(shí)間的延長,NADP/NADPH(Ratio)5min明顯增加后,逐步下降,于1時(shí)達(dá)到最低。
NADP/NADPH的變化提示在氧化應(yīng)激發(fā)生、發(fā)展過程中,磷酸戊糖途徑的代謝活性短暫受到抑制后,逐步增強(qiáng)。
3.內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激
12、的發(fā)生、發(fā)展過程中G6PD的活性及含量的變化。
HUVEC給予10-6mmol/L AngⅡ刺激后,分別于0 min,5min,15min,30min,60min,90min,120min檢測。結(jié)果表明,G6PD的活性隨時(shí)間的延長,呈現(xiàn)先下降后上升的變化規(guī)律,說明氧化應(yīng)激初始期G6PD活性受到抑制,隨著時(shí)間的延長,其活性逐漸恢復(fù)。而G6PD蛋白表達(dá)的變化與G6PD活性的改變呈平行關(guān)系。
4.AngⅡ刺激HUVEC后可
13、使NO的含量、NOS的活性下降。
用相同濃度10-6mmol/L的AngⅡ分別給予細(xì)胞0 min,5min,15min,30min,60min,90min,120min刺激。
A細(xì)胞中NO表達(dá)水平在5min時(shí)升高,之后隨著時(shí)間的延長呈下降性趨勢,并于1時(shí)達(dá)到最低峰。
B細(xì)胞中NOS活性同樣在5min時(shí)出現(xiàn)升高,之后隨著時(shí)間的延長呈下降性趨勢。
細(xì)胞內(nèi)NO含量的降低及NOS活性的下降,說明內(nèi)皮細(xì)胞的
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