CRT、gC1qR及其復(fù)合體在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞損傷中的作用機(jī)制.pdf

1、背景：
　　黑素細(xì)胞破壞或凋亡導(dǎo)致白癜風(fēng)發(fā)病的機(jī)制是皮膚科研究熱點(diǎn)之一。越來越多的證據(jù)表明，氧化應(yīng)激直接導(dǎo)致黑素細(xì)胞損傷或凋亡并啟動(dòng)異常免疫應(yīng)答，是尋常型白癜風(fēng)發(fā)病的重要機(jī)制。
　　鈣網(wǎng)織蛋白（CRT）又稱cC1qR，是補(bǔ)體C1q的主要受體之一，而C1q的另一受體gC1qR表達(dá)于除紅細(xì)胞外的幾乎所有哺乳動(dòng)物細(xì)胞，在炎癥反應(yīng)、病毒感染、腫瘤轉(zhuǎn)移、調(diào)控細(xì)胞凋亡中有重要作用。gC1qR進(jìn)入細(xì)胞線粒體內(nèi)蓄積，能導(dǎo)致線粒體功能障礙，促

2、進(jìn)凋亡；而gC1qR與CRT形成CRT/gC1qR復(fù)合體則可阻止gC1qR線粒體和核轉(zhuǎn)位，促進(jìn)細(xì)胞增殖或遷移。氧化應(yīng)激可影響CRT、gC1qR蛋白表達(dá)和亞細(xì)胞定位，但在表皮組織中，角質(zhì)形成細(xì)胞與黑素細(xì)胞應(yīng)對(duì)氧化損傷有不同模式，CRT、gC1qR的定位及功能變化尚不明確，CRT/gC1qR復(fù)合體的存在與否對(duì)兩種細(xì)胞的影響也亟待闡明。
　　課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)：過氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)氧化應(yīng)激時(shí)，黑素細(xì)胞中的CRT翻轉(zhuǎn)至細(xì)胞膜表面，促

3、進(jìn)部分炎癥因子的表達(dá)。提示白癜風(fēng)發(fā)病早期，氧化應(yīng)激介導(dǎo)黑素細(xì)胞免疫原性增強(qiáng)，啟動(dòng)并促進(jìn)自身免疫應(yīng)答。但CRT膜外翻的具體機(jī)制尚不明確，更關(guān)鍵的是尚未獲得CRT參與黑素細(xì)胞免疫損傷的確切證據(jù)；另外，角質(zhì)形成細(xì)胞中相關(guān)分子的表達(dá)也值得關(guān)注?；谇笆鼋Y(jié)果，我們提出如下假說：氧化應(yīng)激誘導(dǎo)黑素細(xì)胞內(nèi)部顯著的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體應(yīng)激，導(dǎo)致CRT膜外聚集，gC1qR發(fā)生線粒體轉(zhuǎn)位，二者共同作用促進(jìn)細(xì)胞凋亡；而角質(zhì)形成細(xì)胞中，CRT與gC1qR形成CRT/g

4、C1qR復(fù)合體，降低細(xì)胞損傷。
　　目的：
　　1.探討氧化應(yīng)激下調(diào)控CRT的信號(hào)通路及CRT在氧化應(yīng)激介導(dǎo)黑素細(xì)胞免疫損傷中的證據(jù)；
　　2.明確gC1qR、CRT/gC1qR復(fù)合體在黑素細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達(dá)模式及參與氧化損傷的機(jī)制。
　　方法：
　　1.應(yīng)用激光共聚焦組織免疫熒光技術(shù)，觀察白癜風(fēng)患者及正常人表皮黑素細(xì)胞中CRT定位的差異；
　　2.通過應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞早凋/壞死比例，體

5、外構(gòu)建 H2O2誘導(dǎo)的黑素細(xì)胞及角質(zhì)形成細(xì)胞氧化應(yīng)激模型，應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)觀察細(xì)胞模型中CRT的定位；
　　3.應(yīng)用Real-time PCR、western blot篩選上游調(diào)控CRT表達(dá)的信號(hào)通路；并通過干涉片段對(duì)初篩結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，激光共聚焦組織免疫熒光技術(shù)觀察白癜風(fēng)患者及正常人表皮中所篩選相關(guān)通路標(biāo)志分子的表達(dá)；同時(shí)通過分離胞膜蛋白，進(jìn)一步明確上游信號(hào)對(duì)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中CRT的調(diào)控機(jī)制；
　　4.建立PIG1細(xì)胞與白癜

6、風(fēng)患者PBMC共孵育模型，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)及ELISA檢測(cè)不同條件處理后的共孵育模型中CD8+T細(xì)胞的增殖、細(xì)胞因子IFN-γ的表達(dá)水平、DC細(xì)胞成熟標(biāo)志物CD80、CD86、HLA-DR的表達(dá)差異；
　　5.應(yīng)用Real-time PCR、western blot技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞氧化應(yīng)激模型中g(shù)C1qR的表達(dá)，并應(yīng)用激光共聚焦免疫熒光觀察gC1qR的亞細(xì)胞器定位變化；
　　6.應(yīng)用免疫共沉淀技術(shù)分析氧化應(yīng)激模型中 CRT與 gC

7、1qR的相互作用及CRT/gC1qR復(fù)合體的形成，并通過western blot、細(xì)胞免疫熒光技術(shù)觀察CRT、gC1qR、CRT/gC1qR的表達(dá)與定位情況；
　　7.分別應(yīng)用 CRT與 gC1qR的干涉片段處理細(xì)胞后，觀察氧化應(yīng)激條件下二者及CRT/gC1qR復(fù)合體對(duì)細(xì)胞凋亡、線粒體膜電位及細(xì)胞ROS水平的影響；
　　8.通過質(zhì)譜分析及 STRING在線軟件對(duì)黑素細(xì)胞氧化應(yīng)激模型中影響CRT/gC1qR復(fù)合體形成的靶蛋白進(jìn)

8、行預(yù)測(cè)和分析。
　　結(jié)果：
　　1.CRT生理、病理狀態(tài)的定位：
　?、僬Ｈ吮砥そM織中的黑素細(xì)胞CRT定位于胞漿；而白癜風(fēng)表皮組織中殘留的黑素細(xì)胞CRT表達(dá)增加且于胞膜上出現(xiàn)CRT的定位；
　?、跐舛忍荻菻2O2處理黑素細(xì)胞（PIG1、原代MC）及作為對(duì)照的角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT、原代 KC）12h，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡并選擇早期凋亡有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異而壞死無差異的H2O2濃度作為所構(gòu)建氧化應(yīng)激模型的實(shí)驗(yàn)濃度，即

9、PIG1與原代MC細(xì)胞為：400μM，HaCaT及原代KC細(xì)胞為：800μM；本實(shí)驗(yàn)濃度可以成功誘導(dǎo)黑素細(xì)胞中CRT與DiI標(biāo)記的細(xì)胞膜共定位（CRT膜外翻/聚集），并可以在mRNA及蛋白水平以時(shí)間梯度依賴性誘導(dǎo)CRT的上調(diào)；角質(zhì)形成細(xì)胞中未見時(shí)間依賴性的CRT膜外翻。
　　2.氧化應(yīng)激誘導(dǎo)CRT與gC1qR表達(dá)與功能變化：
　?、貶2O2構(gòu)建的黑素細(xì)胞氧化應(yīng)激模型引起gC1qR的表達(dá)上調(diào)及線粒體轉(zhuǎn)位，且具時(shí)間依賴性；與黑素

10、細(xì)胞不同的是，角質(zhì)形成細(xì)胞氧化應(yīng)激模型中g(shù)C1qR的表達(dá)下調(diào)，且主要表達(dá)于細(xì)胞漿，并未發(fā)生顯著的線粒體轉(zhuǎn)位；
　?、诤谒丶?xì)胞氧化應(yīng)激模型誘導(dǎo)的CRT膜聚集和gC1qR線粒體轉(zhuǎn)位，兩者在細(xì)胞內(nèi)無共定位現(xiàn)象；而角質(zhì)形成細(xì)胞氧化應(yīng)激模型則誘導(dǎo)部分CRT與gC1qR形成復(fù)合體。
　　3.CRT與gC1qR在氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞中的機(jī)制：
　?、袤w外氧化應(yīng)激模型可以誘導(dǎo)黑素細(xì)胞未折疊蛋白反應(yīng)UPR發(fā)生的同時(shí)，激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激經(jīng)典的信號(hào)

11、通路；其中PERK相關(guān)通路的激活主要調(diào)控了黑素細(xì)胞CRT的膜聚集，且具有顯著的時(shí)間依賴性；白癜風(fēng)皮損旁組織與正常對(duì)照組織相比磷酸化PERK高表達(dá)；IREIα及ATF6相關(guān)通路的激活與黑素細(xì)胞膜型CRT的表達(dá)無關(guān)；
　?、隗w外與HLA分型一致的患者PBMC構(gòu)建的共孵育模型發(fā)現(xiàn)，黑素細(xì)胞CRT的膜聚集導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞增殖并促進(jìn)IFN-γ的產(chǎn)生；同時(shí)可以促進(jìn)DC細(xì)胞表面成熟標(biāo)志物CD86及HLA-DR的表達(dá)；
　?、垩趸瘧?yīng)激下，

12、黑素細(xì)胞中的CRT與gC1qR均參與細(xì)胞的凋亡，發(fā)揮促凋亡的作用，其中CRT主要導(dǎo)致細(xì)胞早期凋亡，gC1qR可以導(dǎo)致線粒體內(nèi)膜發(fā)生去極化、膜電位下降，并引起胞內(nèi)ROS的蓄積；與黑素細(xì)胞相反，角質(zhì)形成細(xì)胞中CRT/gC1qR復(fù)合體的形成阻止了CRT引起的細(xì)胞早凋、gC1qR誘導(dǎo)的線粒體膜電位下降及胞內(nèi)ROS的蓄積；SRSF1、NCAPD2、HSP90AA1、SCARF1、TUBB2C可能與黑素細(xì)胞CRT競(jìng)爭結(jié)合gC1qR從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。