HO-1在軟脂酸誘導的神經細胞氧化應激中的作用研究.pdf

1、目的:阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種慢性神經系統(tǒng)退行性疾病，以進行性記憶和認知功能減退為主要表現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)，AD病人腦中中、長鏈和極長鏈脂肪酸水平增加，提示飽和脂肪酸可能在AD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。氧化應激是AD的重要致病機制。軟脂酸(C16)等飽和脂肪酸可通過多種機制促進活性氧(reactive oxygenspecies，ROS)的產生，誘發(fā)氧化應激，在AD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。因此，利用

2、抗氧化劑減少氧化應激引起的腦損傷，有可能成為防治AD的重要靶點。
　　血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)是腦內的抗氧化酶之一，可通過其代謝產物（膽紅素等）清除活性氧，減輕氧化應激對細胞造成的損傷。HO-1基因上游有抗氧化反應元件(antioxidant response element，ARE)。核轉錄因子NRF2(Nuclear factor erythroid-derived2-1ike2)是ARE

3、的激活因子。正常情況下，NRF2位于胞漿，當細胞發(fā)生氧化應激時，NRF2在ERK等激酶作用下發(fā)生磷酸化，轉入細胞核，啟動HO-1的轉錄。AD病人腦中HO-1表達有增加。提示，HO-1可能通過代償性表達增加，提高腦的抗氧化能力，來抵御AD的病理進程。
　　本實驗擬以軟脂酸C16作為刺激因素，以神經母細胞瘤BE(2)-M17細胞為研究對象，在細胞水平研究在飽和脂肪酸誘發(fā)的神經細胞氧化應激狀態(tài)下，HO-1的上調機制及其抗氧化作用，為尋找

4、AD的防治靶點提供理論和實驗依據(jù)。
　　方法:
　　1、細胞培養(yǎng)
　　常規(guī)培養(yǎng)神經母細胞瘤BE(2)-M17細胞。
　　2、ROS含量測定
　　DHE染色法或化學發(fā)光法檢測細胞中ROS的含量。
　　3、實時定量RT-PCR檢測目的基因mRNA表達水平
　　Trizol法提取細胞總RNA。取2μg總RNA進行反轉錄。以18S rRNA做內參，實時定量PCR測定HO-1和NRF2 mRNA的相對表達

5、量。
　　4、Western blot檢測目的基因蛋白表達水平
　　提取神經細胞總蛋白，Western blot測定HO-1、NRF2和ERK蛋白的相對表達量以及p-ERK的蛋白水平。
　　5、細胞免疫熒光染色檢測目的基因的定位或蛋白水平
　　對神經細胞進行免疫熒光染色，觀察細胞內HO-1和NRF2的蛋白表達水平以及NRF2的入核情況。
　　6、數(shù)據(jù)處理
　　采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件進行處理分析

6、。數(shù)據(jù)以(x)±SD表示，多組樣本之間兩兩比較用多個均數(shù)比較的方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　1、軟脂酸(C16)誘導神經細胞氧化應激。
　　給予細胞不同劑量的C16刺激2h，DHE染色法檢測細胞中的ROS水平。結果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，給予C16刺激后，細胞中的ROS呈劑量依賴性增加，并在200μM達到高峰。表明，軟脂酸誘導神經細胞出現(xiàn)氧化應激。
　　2、氧化應激狀態(tài)下，神經細胞中H

7、O-1的表達代償性增加。
　　給予細胞不同劑量的C16刺激2h，實時定量RT-PCR檢測HO-1mRNA的表達，Western blot和細胞免疫熒光染色檢測HO-1的蛋白表達。結果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，給予C16刺激后，細胞中HO-1的mRNA和蛋白表達均呈劑量依賴性增加。表明，氧化應激狀態(tài)下，HO-1的表達代償性增加。
　　3、HO-1的表達上調可減輕軟脂酸誘導的神經細胞氧化應激。
　　1)氧化應激狀態(tài)下，ERK激酶

8、被激活。
　　給予細胞不同劑量的C16刺激2h，Western blot檢測ERK激酶的表達及其磷酸化水平。結果顯示，給予C16刺激后，細胞中ERK的表達沒有明顯改變，但p-ERK的水平呈劑量依賴性增加。表明，氧化應激狀態(tài)下，ERK激酶被激活。
　　為了進一步明確ERK的活化與HO-1的表達之間的關系，將實驗分為四組:對照組，C16組，ERK抑制劑組和ERK抑制劑+C16組。Westernblot檢測HO-1的表達和ERK的

9、表達及其磷酸化水平。發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，單獨給予C16后，HO-1的表達和p-ERK的水平明顯升高;而同時給予C16和ERK抑制劑后，與單獨給予C16相比，HO-1的表達和p-ERK的水平明顯降低。ERK的表達各組沒有明顯差異。表明，HO-1的表達上調可能與ERK相關信號途徑的活化有關。
　　2)氧化應激狀態(tài)下，核轉錄因子NRF2被活化。
　　給予細胞不同劑量的C16刺激2h，細胞免疫熒光染色檢測ERK的底物，HO-1的上游

10、調控因子NRF2的活性，即NRF2的入核情況。發(fā)現(xiàn)，給予C16刺激后，細胞核中NRF2的水平明顯增加。同時，用實時定量RT-PCR和Western blot檢測NRF2的表達。結果顯示，與對照組相比，給予C16刺激后，NRF2的mRNA和蛋白表達均明顯增加。表明，HO-1的表達上調可能與ERK活化NRF2有關。
　　3) HO-1的表達上調可減輕軟脂酸誘導的氧化應激。
　　實驗分為四組:對照組，NRF2激動劑組，C16組和N

11、RF2激動劑+C16組。Western blot結果顯示，與對照組相比，單獨給予C16或NRF2激動劑后，HO-1的表達升高，而同時給予C16和NRF2激動劑后，與單獨給予C16或NRF2激動劑相比，HO-1的表達升高更為明顯?；瘜W發(fā)光法檢測細胞內ROS水平，結果顯示，單獨給予C16刺激，與對照組相比，ROS的水平明顯增高;而同時給予C16和NRF2激動劑后，與單獨給予C16相比，ROS的水平明顯降低。表明，上調HO-1的表達可以減輕軟